Antimicrobial Activity Against Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis of Clove Bud Essential oil and Inhibitory Effect on Biofilm Formation

정향 정유(Syzygium aromaticum Merrill et Perry)의 Streptococcus mutans와 Porphyromonas gingivalis에 대한 항균 활성과 바이오필름 형성 억제 효과

Abstract

Purpose: This study aims to test the efficacy of clove bud essential oil (CBEO) as a composition for preventing and treating oral diseases, including dental caries and periodontal inflammation by verifying its antibacterial effect, growth inhibition effect, and biofilm formation inhibitory effect against both Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis. Method: Clove bud essential oil (CBEO) was diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO), and the final concentrations were 10 %, 15 %, 20 %, and 30 %. The antimicrobial activity against S. mutans and P. gingivalis for each concentration was verified by the disk diffusion method. In addition, the minimum inhibition concentration (MIC) was measured at the concentrations of 0 %, 0.3 %, 0.7 %, 1.5 %, 3 %, 6.25 %, and 12.5 %. The growth inhibitory effect was estimated at the absorbance of 600 nm every 0, 3, 6, 12, and 24 hours of S. mutans and P. gingivalis. After 48 hours of treatment, biofilm formation was analyzed followed by each concentration. Results: CBEO exhibited a strong antimicrobial effect on S. mutans and P. gingivalis, especially it showed potent antimicrobial efficacy from the lowest concentration of 10% against S. mutans. The growth inhibition was also occurred by 10 % CBEO treatment against both strains, but there was no significant dose-dependency. In addition, the biofilm formation against S. mutans and P. gingivalis was inhibited by more than 40-50 % at 10 % CBEO treatment, without any significant concentration-dependent manner. Conclusion: This study showed that CBEO had more potent antimicrobial activities, such as clear zone formation, growth inhibition effect, and biofilm formation inhibitory effect against S.mutans than those of P. gingivalis. These results indicate that CBEO could be used as a compositionin of toothpaste and gargle for children who are exposed at high risk of dental caries.

Ⅰ. 서론

1. 연구의 배경 및 필요성

2022년 치과 외래 방문자 수는 2,424만 명으로 전체 국민의 47.1 %가 이용하였고, 19세 이하에서는 치아우식증, 20세 이상에서는 치은염과 치주질환의 내원 비율이 높게 나타난 것은 전 연령에서 구강건강 관리의 중요성을 뒷받침하고 있다(Health Insurance Review and Assessment Service, 2023). 또한 1인당 평균 외래진료비는 치은염 및 치주질환 106,116원, 치아우식증 92,361원으로 지속적으로 증가하고 있어 개인에게는 통증과 경제적 부담감을 주고 치아우식증과 치주질환의 치료와 예방을 위해 치과 건강보험 확대로 인한 사회경제적 부담을 가중 시키고 있다(Eom 등, 2021). 치아우식증은 치아 맹출 직후부터 지속적으로 발생위험이 높아지며, 치료 후에도 개인이 잘 관리하지 못하면 재발하는 만성질환으로 알려져 있다(Lee 등, 2020). 치주질환은 20세 이후 발생빈도가 높으며, 연령이 증가함에 따라 치주조직의 염증과 치조골의 파괴로 이어져 치아 상실을 유발하는 주요 원인으로, 치아우식증과 치주질환을 예방하기 위한 다양한 노력을 기울이고 있다(Chun & Choi, 2022).

치아우식증과 치주질환을 유발하는 주요 인자는 치면 세균막(plaque)으로 400종이 넘는 bacteria로 구성되어 있고 치아우식증은 Streptococcus mutans, 치주질환은 Porphyromonas gingivalis가 대표적으로 알려져 있다(Park 등, 2010). S. mutans는 그람양성균으로 치면에 붙어 음식물 섭취에 따른 과당과 포도당 성분을 이용하여 젖산을 생산하고 불용성의 글루칸으로 합성 후 유해균의 치면 부착이 쉽게 하여 미생물들의 집락 형성에 따라 무기질 탈회를 촉진하고 치아우식증의 진행 속도를 높인다(Hamada 등, 1984; ten Cate, 2006). P. gingivalis는 그람음성균으로 아민, 암모니아, 지질다당류 등의 독성 성분을 분비하고 대사산물로 inflammatory cytokine을 과량 생성하여 치주의 염증을 유발한다(Han 등, 2016). 이때 적절한 방법으로 치면세균막(plaque)를 제거하지 않고 방치하게 되면 치태에서 치석으로 고착화되어 치아를 둘러싸고 있는 조직들이 파괴되어 치아의 동요도가 증가하여 치아를 상실하게 된다(Hwang 등, 2015). 최근 여러 연구에서 치주질환은 단순히 구강질환에서 끝나는 것이 아니라 심근경색, 고혈압, 동맥경화, 알츠하이머, 당뇨, 치매 등과 밀접한 관련성이 있는 것으로 보고하였다(Salma 등, 2023).

치아우식증과 치주질환을 유발하는 미생물들의 생성과 성장억제를 위해 다양한 항균제를 사용하여 효과를 보이고 있으나, 미각 마비, 불쾌한 맛, 통증, 착색, 작열감 등의 다양한 부작용을 유발하고 있다(James 등, 2017; Lee 등, 2011). 부작용 없이 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 항균 효과를 보이는 천연추출물 중 오랜 기간 다양한 추출법으로 여러 나라에서 약용식물로 사용되고 있는 허브(herb)에 대한 관심은 꾸준히 증가하고 있다(Choi 등, 2020). 허브의 종류에 따라 줄기, 입, 꽃을 원료로 하여 수증기 추출법, 용매추출법, 냉동압착추출법 등의 다양한 방법을 이용하여 에센셜오일(essential oil)로 활용하였다(Ju 등, 2016). 이러한 에센셜오일은 추출원료에 따라 근육통 이완과 완화, 신경안정, 여드름균에 대한 항균 효과, 잡곡류 보관을 위한 천연보존제 등으로 다양하게 활용되고 있다.

천연물에 대한 연구는 꾸준히 이루어지고 있으며 박하 추출물(Choi 등, 2020)과 녹차 추출물(You 등. 2022)은 S. mutans와 P. gingivalis에 모두 항균 효과를 보였다. 천연물 중 정유 상태로 항균 효과를 보인 것은 유칼립투스(eucalyptus), 티트리(tea), 라벤더(lavender), 레몬그라스(lemongrass) 등이 S. mutans에 항균 효과를 보였고, P. gingivalis에는 레몬그라스(lemongrass), 페퍼민트(peppermint), 베르가못(bergamot), 시나몬(cinnamon)오일 등에서 항균 활성을 보였다(Yoon & Park, 2022).

정향(clove bud, Syzygium aromaticum Merrill et Perry)은 도금양 과로 서양과 중국에서는 음식의 향신료로 많이 사용하였고, 살균력이 우수한 것으로 알려져 있으며(Kim 등, 2001), 우리나라에서는 동의보감에 소화장애나 허리 무릎관절 통증 치료에 사용한 것으로 알려져 있다(Jang 등, 2018; Shin, 2019). 정향의 주성분은 유지놀(eugenol), 티아민(thiamine), 리보플래빈(riboflavin), 나이아신(niacin.), 판토텐산(pantothenic), 철분과 마그네슘 등의 미네랄을 포함하고 있다. 이러한 정향은 치과에서 치수 진정 작용을 하는 임시 수복 제로 널리 사용되고 있고(Oh, 2017), 산화스트레스 완화(Singh 등, 2009) 항바이러스(Kang 등, 1999), 항균 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나(Kwak 등, 2001), 정향을 구강질환의 대표 균주에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 S. mutans와 P. gingivalis의 성장억제 효과와 Biofilm 형성 억제 효과를 검증하고자 한다. 또한 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 에센셜 오일들의 활용도를 고려할 때 많이 연구들이 이루어지지 못하고 있다.

2. 연구의 목적

본 연구는 진통 효과와 항균 효과가 있는 것으로 알려진 clove bud 에센셜 오일의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 항균 활성, 성장억제 효과 및 바이오필름 형성 억제 효과를 검증하여 구강질환의 예방용 조성물과 치료제로서의 활용 가능성을 검증하고자 한다.

Ⅱ. 연구방법

1. 실험 재료

Clove bud essential oil(CBEO)의 학명은 Eugernia caryophyllata로 원산지는 마다가스카(Madagascar)로 말린 꽃봉오리를 이용하여 수증기 증류법(water vapor distillation)으로 추출하였으며, 본 연구에 사용한 제품은 absolute aromas clove bud(Absolute aromas, Hampshire, UK)를 이용하였다. 100 % oil을 dimethyl sulfoxide(DMSO, MilliporeSigma, USA)를 이용하여 희석 농도 10 %, 15 %, 20 %, 30 %(v/v)를 사용하였다.

2. 실험 균주 배양 조건

구강병의 대표 원인 균주인 S. mutans (KCTC 3065)와 P. gingivalis (KCTC 5352)는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korea)에서 분양 후 brain heart infusion broth (BHI, Difco Laboratories Inc., USA) 배지에 접종하여 37 ℃ shaking incubator (200x rpm, Daehan Lab. Science, Korea)에서 24시간 배양하여 사용하였다.

3. 디스크 확산법(disk diffusion method)을 이용한 CBEO 항균능 측정

CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 항균 활성을 검증하기 위해 디스크 확산법(Disk diffusion method)을 이용하였다. S. mutans와 P. gingivalis를 평판배지에 20 ㎕ 접종하고 spreader(SPL Life Sciences, Korea)로 도말하였다. 구획을 나누어 직경이 8 ㎜의 멸균된 paper disk(Advantec, Toyo Roshi, Ltd., Japan)를 배지 표면에 밀착시킨 후 CBEO를 각각 10, 15, 20, 30 %(v/v)농도로 20 ㎕씩 점적하였다. 37 ℃로 유지되는 incubator에서 24시간 배양 후 생성된 투명환(clear zone)을 디지털 캘리퍼스(DC150/200-2, CAS, Korea)를 이용하여 측정하였다.

4. CBEO의 최소억제농도(minimum inhibition concentration; MIC) 측정

S. mutans와 P. gingivalis에 대한 CBEO의 최소억제농도를 측정하기 위하여 0.3, 0.7, 1.5, 3, 6.25, 12.5 %(v/v) 농도로 희석하여 사용한다. OD₆₀₀값이 0.3이 되도록 한 후 96-well plate(SPL Life Science) 희석된 각 균주를 100 ㎕씩 분주하고, 희석된 CBEO를 100 ㎕씩 추가 분주하여 섞은 다음 37℃ 24시간 배양하였다. 최소억제농도는 microplate reader(BioTek Instruments Inc., Winooski, USA)를 이용하여 600 ㎚에서 흡광도에서 측정 후 분석하였다.

5. 성장억제 효과(growth inhibition)

CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 성장억제 효과(growth inhibition)는 액체배지 희석법을 이용하였으며, 각 균주는 BHI broth에서 24시간 배양 후 OD₆₀₀ 값이 0.4가 되도록 희석하여 사용하였다. BHI broth에 각 10, 15, 20, 30 %(v/v) 농도로 20 ㎕씩 희석한 후 37 ℃ shaking incubato r(200x rpm)에서 배양하였다. 배양 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간이 되었을 때 microplate reader(BioTek Instruments Inc., USA)를 이용하여 600 ㎚에서 흡광도에서 측정하였다.

6. Biofilm 형성 억제효과

CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 바이오필름 형성 억제 효과를 파악하기 위하여 Moon 등(2019)의 측정법을 이용하였다. S. mutans와 P. gingivalis를 BHI broth에서 배양하여 OD₅₇₅ 값이 0.1이 되도록 희석 후 24-well plate(SPL Life Science)에 2 ㎖씩 분주한 후 CBEO가 0, 10, 15, 20, 30 %(v/v) 농도로 각각 처리하고 48시간 37 ℃ incubator에서 배양하였다. 24-well plate의 배지 상층을 제거하고 3차 증류수를 이용하여 2회 세척한 후 24-well plate에 형성된 Biofilm을 0.1 % crystal violet으로 15분간 염색하였다. 다시 3차 증류수로 2회 세척 건조 후 33% acetic acid를 각 well에 1 ㎖씩 분주하여 10분간 crystal violet을 용출시키고 96-well plate(SPL life science)에 200 ㎕씩 분주하고 microplate reader(BioTek Instruments, Inc. USA)의 OD₅₇₅ 값에서 흡광도를 측정하였다.

7. 통계적 방법

모든 실험은 3회 반복 측정한 값의 평균값을 이용하였으며 통계분석은 SPSS 29.0 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 CBEO의 농도에 따른 항균능을 검증하기 위해 일원배치분산분석법(one-way ANOVA)을 실시하였으며 균주와 농도별 평균 ± 표준편차를 제시하고 사후 검증은 Duncan's test를 이용하였으며, 통계적 유의수준은 .05로 하였다.

Ⅲ. 결과

1. CBEO의 디스크 확산법을 이용한 항균능

CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 항균능은 Table 1과 같다. S. mutans에서는 10 % 농도에서 21.62 ㎜, 15 % 농도에서 24.57 ㎜, 20 % 농도에서 25.59 ㎜, 30 % 농도에서 28.86 ㎜로 10 % 농도에서도 높은 항균능을 보였고 농도 의존적으로 항균능을 보였다(p<.001). P. gingivalis에서는 10 % 농도에서 16.60 ㎜, 15 % 농도에서 19.56 ㎜, 20 % 농도에서 21.59 ㎜, 30 % 농도에서 24.41 ㎜로 10 % 농도에서도 높은 항균능을 보였고 농도 의존적으로 항균 효과를 보였다(p<.001). 또한 CBEO의 항균 효과는 S. mutans와 P. gingivalis에서 모두 확인되었으며, 특히 S. mutans에서는 상대적으로 낮은 농도에서도 높은 활성을 보인 점에서 차이를 보였다.

Table 1. Antibacterial Activity of CBEO against S. mutans and P. gingivalis

2. CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 최소억제농도(MIC)

CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 최소억제농도는 Table 2와 같다. S. mutans의 최소억제농도는 0.7 %(v/v)였고, P. gingivalis는 1.5 %(v/v)로 S. mutans의 최소 억제농도가 더 낮은 것으로 나타났다.

Table 2. MIC (24 h) of CBEO against S. mutans and P. gingivalis

3. CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 성장억제 효과

CBEO의 농도별로 S. mutans와 P. gingivalis를 접종 후 0시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 각각 배양 후 600 ㎚ 흡광도에서 성장억제 효과를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다(Fig 1). S. mutans는 24시간 후 양성대조군 0.59을 기준으로 10 % 0.16, 15% 0.11, 20 % 0.12, 30 % 0.13으로 10 % 에서부터 성장억제 효과를 보였고, 성장억제 효과는 농도 의존성을 보이지 않았다. P. gingivalis는 양성대조군 0.63를 기준으로 10 % 0.14, 15 % 0.12, 20 % 0.12, 30 % 0.12로 10 %에서부터 성장억제 효과를 보였고 농도 의존성은 낮았다. 두 균주 모두 12 시간에서 성장이 급격히 증가하여 이후 낮아지는 경향을 보였으며, CBEO는 10 % 농도에서도 두 균주 모두에서 성장억제 효과를 보였다.

Fig 1. Growth inhibitory effects of CBEO on S. mutans, and P. gingivalis

4. CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 Biofilm 형성 억제 효과

CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 biofilm 형성 억제 효과 분석 결과는 Fig 2와 같고 CBEO의 농도는 0, 10, 15, 20, 30 % 농도로 48시간 배양 후 biofilm 형성 억제 효과는 대조군(a)을 100 %로 하여 분석한 결과이다. S. mutans에서 CBEO의 농도가 10 % 일 때 63.72 %의 biofilm 형성률을 보였고, 15 %는 17.09 %, 20 %는 17.70%, 30 %는 13.33 %로 biofilm 형성률을 보여 농도 의존성을 보였다(p<.001). P. gingivalis에서 CBEO의 농도가 10 %는 52.19 %와 15 %는 52.43 %의 biofilm 형성률을 보였고, 20 %는 37.60 %, 30 %는 40.45 %로 biofilm 형성률을 보였으나 농도 의존성은 없었다(p<.001). CBEO의 biofilm 형성 억제 효과는 10 %에서는 P. gingivalis에서 억제 효과가 높은 반면, 농도의 증가에 따른 biofilm 형성 억제 효과는 S. mutans에서 월등히 높았다.

Fig 2. Inhibitory effect of CBEO on biofilm formation by S. mutans (A) and P. gingivalis (B) for 24h in BHI broth

Ⅳ. 고찰

CBEO의 치과에서 치수 진정 효과를 위해 사용하는 유지놀(eugenol) 성분을 함유하고 있으며(Oh, 2017), 치아 통증 완화, 근육통 완화, 스트레스 감소 등을 목적으로 널리 사용되고 있는 에센셜 오일 중 하나이다(Shin, 2019). 허브 종류와 추출 방법에 따라 다양한 에센셜 오일들이 제조, 유통 판매 중이며 이들에 대한 약리효과 검증은 지속적으로 이루어지고 있다(Baek 등, 2013). 그 중에서도 레몬그라스(lemongrass), 라벤더(lavender), 시나몬(cinnamon) 등은 S. mutans와 P. gingivalis에 항균능을 보유하고 있다(Yoon & Park, 2022). 정향의 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 항균 효과를 검증하기 위해 억제대, 성장억제 효과, 바이오필름 형성 억제 효과를 동시에 검증함으로써 CBEO의 활용 가능성을 높이고자 하였다.

CBEO의 디스크 확산법을 이용한 S. mutans의 억제대는 10 % 21.62 ㎜, 15 % 24.57 ㎜, 20 % 25.59 ㎜, 30 % 28.86 ㎜로 농도 의존적 경향을 보여 LCEO에서 10 % 17.25 ㎜, 15 % 20.05 ㎜, 20 % 26.83 ㎜, 30 % 31.63 ㎜를 보여(Park & Yoon, 2023), 10 %의 저농도에서는 CBEO의 억제대가 크게 나타났으나 농도 의존적 경향은 LCEO에서 더 크게 나타나 차이를 보였다. 또한 P. gingivalis에서는 10 % 16.60 ㎜, 15 % 19.56 ㎜, 20 % 21.59 ㎜, 30 % 24.41 ㎜를 보여 LGEO에서 10 % 15.24 ㎜, 20 % 24.08 ㎜, 30 % 31.22 ㎜에서의 결과와 유사한 결과를 보였다(Yoon & Park, 2023).

CBEO의 최소억제농도는 S. mutans는 0.7 %, P. gingivalis는 1.5 %에서 나타났다. 이는메이창 에센셜 오일에서 S. mutans와 P. gingivalis에 대한 최소억제농도가 두 균주 모두에서 1.5 %로 다소 차이를 보였고(Park & Yoon, 2023), B. cereus, S. aureus, E. coli 균주 등에서 MIC가 1.25 ㎎/㎖로 S. mutans에서 보다는 최소억제농도가 높았다(Kim & Kim, 2021).

CBEO의 성장억제 효과는 24시간 후 S. mutans에서 24시간 후 성장억제 효과는 10 % 0.16, 15 % 0.11, 20 % 0.12, 30 % 0.13으로 S. mutans에서는 10 %부터 성장억제 효과가 나타났다. 이는 Kim 등(2016)의 연구에서 24시간 후 흡광도 측정 결과 오렌지 에센셜 오일 0.24, 콩기름 0.23, 올리브오일 0.23으로 본 연구에서 10 % 보다 높은 흡광도를 보여 성장억제 효과는 CBEO가 높은 것으로 보였다. P. gingivalis는 10 % 0.14, 15 % 0.12, 20 % 0.12, 30 % 0.12로 보였고, Yoon과 Park(2023)의 연구에서 레몬그라스 에센셜 오일은 10 %에서 0.12, 20 %에서 0.11, 30 %에서 0.09의 흡광도를 보여 본 연구 결과와 유사한 성장억제 효과를 보였다 CBEO의 성장억제 효과는 두 균주 모두 효과를 보였고, S. mutans에서 다른 연구 결과 보다 높은 성장억제 효과를 보였다.

CBEO의 biofilm 형성률은 S. mutans에서 CBEO의 농도가 10 % 일 때 biofilm 형성률 63.72 %, 15 %는 17.09 %, 20 %는 17.70 %, 30 %는 13.33 %로 15 % 이상에서 biofilm 형성률은 큰 차이가 없었다. 이는 Park과 Yoon(2023)의 연구에서 10 % 농도에서 형성률이 20 %로 본 연구보다 바이오필름 형성률이 낮은 농도에서 효과성이 높았으나 15% 이상의 농도에는 차이가 없었다. 또한 P. gingivalis는 10 %는 52.19 %, 15 %는 52.43 %, 20 %는 37.60 %, 30 %는 40.45 % biofilm 형성률을 보여 매스틱 오일(mastic oil)을 이용한 0.2 % 농도에서 부착력 측정 결과 대조군의 50 % 형성 억제 효과를 보여 낮은 농도에서 높은 효과를 보였고(Lee 등, 2020), 본 연구와는 차이를 보였다. 그러나 본 연구에서 진행한 바이오필름 억제 효과와 Lee 등(2020)의 부착력의 차이가 있어 추후 낮은 농도에서 같은 방법으로 연구 진행이 필요하다.

따라서 CBEO는 S. mutans에서 최소억제농도가 가장 낮았고 낮은 농도에서도 투명환의 크기가 컸으며, 성장 억제 효과와 biofilm 형성 억제 효과가 커 치아우식증에 취약한 소아와 청소년들을 위한 다양한 제품에 적용 가능할 것으로 생각된다.

Ⅴ. 결론

본 연구는 CBEO의 S. mutans와 P. gingivalis 항균 효과와 성장억제 효과 및 바이오필름 형성 억제 효과를 검증하여 구강병 예방 및 치료용 조성물로 활용 근거를 마련하고자 한다. CBEO는 S. mutans와 P. gingivalis 모두에서 항균 활성을 보였고, 특히 S. mutans에서는 10% 농도에서부터 강력한 항균 효과를 나타냈다. 또한 CBEO는 10 %에서 두 균주 모두 성장억제 효과를 보였고 농도 의존적인 경향은 보이지 않았다. S. mutans와 P. gingivalis에 대한 biofilm 형성은 10 %에서 40~50 % 이상의 억제 효과를 보였으나 농도 의존적인 경향은 낮았다. 본 연구 결과 정향 에센셜 오일은 P. gingivalis 보다 S. mutans에서 낮은 농도부터 억제대 생성, 성장억제 효과, 바이오필름 형성 억제 효과 모두 높게 나타나 치아우식증의 위험에 노출이 많은 어린이들을 대상으로 한 치약, 가글 등에 활용 가능성을 검증하였다. 이를 기초로 정향 에센셜 오일의 안정성과 장기적 효과를 검증하기 위하여 동물 실험과 임상실험 등의 추가 연구를 통해서 치아우식증 예방 조성물과 치료제로의 활용성을 높여야 할 것이다.