Tyrosinase Inhibitory Effect of Seaweeds Fermentation Extracts in 𝛼-MSH Stimulated B16F10 Cells

B16F10 세포에서 해조류 발효 추출물의 Tyrosinase 억제 효과

Abstract

Purpose : Melanin is a brown or black pigment that determines the colour of the skin and hair, which can protect the skin from UV. By the way, melanin can cause various disorders such as melasma, freckles, and even melanoma when it is overproduced. Therefore, many studies have been performed on natural products to improve these symptoms. In this study, four types of brown seaweeds, Saccharina japonica, Hizikia fusiforme, Undaria pinnatifida, and Sargassum fulvellum, were fermented using Lactobacillus sakei, and analysed for their whitening effects on B16F10 melanocytes. Methods : The cytotoxicity of fermented seaweeds extracts on RAW 264.7 cells and B16F10 cells was evaluated by the WST-1 assay. The Griess reaction was performed to measured the produced nitric oxide (NO) concentration. To identify the whitening activity of four kinds of seaweeds fermentation extracts, in vitro tyrosimase activity and melanin content were analyzed. Results : High concentrations of S. japonica and S. fulvellum induced mild cytotoxicity in RAW 264.7 cells, but the other samples showed no significant toxicity in both RAW 264.7 and B16F10 cells. The four fermented seaweed extracts significantly inhibited the production of LPS-induced NO in RAW 264.7 cells, with H. fusiforme and U. pinnatifida showing stronger anti-inflammatory activity than that of others. The inhibitory effect of in vitro tyrosinase activity was in the order of U. pinnatifida, S. fulvellum, H. fusiforme, S. japonica. The melanin synthesis induced by 𝛼-MSH was also inhibited by the four kinds of agents, which was in consistent with the tyrosinase assay. Conclusion : These results are thought to be due to the increased concentration of various active substances during the fermentation process, and it is necessary to analyse which substances were increased in this study in the future. Based on these results, four kinds of fermented seaweeds extracts have the potential to be used as whitening functional cosmetic ingredients.

Ⅰ. 서론

1. 연구의 배경 및 필요성

멜라닌은 피부, 머리카락, 눈의 색을 결정하는 갈색 또는 흑색의 색소로 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있으나 과잉 생산되는 경우 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 여러 색소 침착 증후군을 유발하기도 하고, 심한 경우 피부암의 원인이 되기도 한다(Inoue 등, 2023). 특히, 피부의 색은 혈액 내 헤모글로빈, 피부조직에 분포하는 β-카로틴의 농도 등에 일부 영향을 받기도 하지만 주로 멜라닌 색소의 분포와 양에 가장 큰 영향을 미친다(Kato 등, 2022). 이러한 멜라닌은 자외선과 활성산소 등에 의해 피부의 바닥층에 존재하는 멜라닌세포의 tyrosinase 발현이 유도되면서 생성이 시작된다. 자외선에 의해 피부 각질세포의 p53 단백질이 활성화되고 adrenocorticotropic hormone(ACTH)에 의해 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)가 생성되면, α-MSH는 멜라닌세포에 존재하는 melanocortin 1 receptor와 결합하여 c-AMP 농도를 증가시키고, cAMP response element binding protein(CREB)이 활성화되면서 인산화가 일어난다. 인산화된 CREB은 microphthalmia associated transcription factor(MITF)의 발현을 유도하고, MITF는 tyrosinase related protein 1(TRP-1), TRP-2와 함께 멜라닌 합성의 주효소로 작용하는 tyrosinase를 촉진시킨다(Lee 등, 2024). Tyrosinase는 기질인 L-tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)로 수산화하고, L-DOPA가 dopaquinone으로 산화하는데 촉매작용을 하여 최종적으로 melanin을 생성하는데 가장 주요한 역할을 한다(Ni 등, 2025). 이러한 과정을 통해 생성되는 멜라닌의 제거를 위해 많은 생리활성 물질들이 연구되어 왔다. 그 중 kojic acid와 arbutin은 뛰어난 tyrosinase 억제 효과로 잘 알려진 미백 소재였으나, 피부 자극과 같은 안전성 문제뿐만 아니라 일부 부작용으로 인해 사용에 제한이 있어, 최근 부작용이 적은 미백 기능성 신소재의 개발을 위한 많은 연구가 진행되고 있다.

해조류는 녹조류, 홍조류, 갈조류로 분류되고 비타민, 무기질, 필수아미노산 등이 풍부하여 식품, 의약품 등으로 사용된다. 특히, 해조류의 탄닌류, 카테킨류 등과 같은 생리활성성분은 면역조절능, 항염증능, 항암능 등의 다양한 활성이 보고되었다(Vo 등, 2012). 그중 다시마, 톳, 미역은 항당뇨, 항염증 등의 활성이 보고되었고(Kang 등, 2018a; Kim 등 2023), 참모자반은 항암, 항균 및 항산화 효과가 보고되었다(Bae, 2004; Lee 등, 2000). 특히, 톳, 모자반은 멜라닌 합성에 미치는 효과에 대한 몇몇 연구가 보고되었으나 미역과 다시마는 혼합 발효 추출물에 대한 미백효과만 보고되었다(Choi 등, 2013; Kang 등 2018b; Sim 등, 2024). 이러한 다양한 생리활성을 나타내는 해조류는 기능성 식품뿐만 아니라 여러 산업 분야에서 중요 자원으로 받아들여지고, 이의 산업적인 활용도를 높이기 위해 최근 유산균과 효모종을 이용한 새로운 해조류 발효 제품을 만드는 기술이 개발되고 있다. 이렇게 개발된 제품은 폴리페놀 함량과 생리활성 화합물의 생체 이용률을 증가시켜 기존 해양자원의 부가가치를 높일 수 있는 새로운 방법이 되고 있다(Choi 등, 2024).

본 연구에서는 4종류의 갈조류인 다시마(Saccharina japonica), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida), 모자반(Sargassum fulvellum)을 Kang 등(2018b)의 연구에서 사용된 김치유산균인 Lactobacillus sakei를 이용하여 발효시킨 후 B16F10 멜라닌 세포에서 미백효과를 분석하였다.

2. 연구의 목적

본 연구에서는 L. sakei로 발효한 네 종류의 해조류인 다시마(S. japonica), 톳(H. fusiforme), 미역(U. pinnatifida), 참모자반(S. fulvellum) 추출물의 항염증 효과를 RAW 264.7 세포에서, 미백효과를 in vitro tyrosinase 억제 활성과 α-MSH에 의해 멜라닌 합성이 촉진된 B16F10 세포에서 분석하였다. 이를 통해 멜라닌의 과형성으로 발생할 수 있는 피부 손상을 완화할 수 있는 기능성 소재 개발을 위한 후보 물질을 도출하고자 하였다.

Ⅱ. 연구방법

1. 연구대상 및 방법

1) 세포배양 및 시약

생쥐 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 생쥐 흑색종 세포주인 B16F10 세포는 10 % fetal bovine serum(Cytiva, USA)의 영양성분과 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin(Cytiva, USA) 항생제가 첨가된 Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM, Cytiva, USA)을 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂, 습윤 조건에서 배양하였다.

2) 다시마, 톳, 미역, 모자반 발효 추출물 준비

건조된 해조류인 다시마, 톳, 미역, 모자반은 완도네미역(상호명: 오로시)에서 구입하였다. 건조 후 분쇄한 각각의 시료를 4배 부피의 70 % 식용 에탄올(주정)에 섞은 후 50 ℃에서 24시간동안 환류하며 추출하였다. 추출 시료는 1 ㎛ 필터로 여과하고 진공농축기(N-110, Eyela Co., Japan)를 이용하여 농축하였다. 추출물은 김치유산균인 Lactobacillus sakei(KCTC No. 3603, Korea)를 이용하여 발효하였다(Kang 등 2018b). 유산균은 MRS broth(Difco Co., USA)에 전지분유 1 %, 해조류 추출물 10 %를 섞은 후 잡균의 제거를 위하여 80 ℃로 2시간 동안 가열살균 후 유산균을 1 % 농도로 접종하고 30 ℃에서 72시간동안 배양하였다(Lee 등, 2019). 그리고 발효 후 유산균의 사멸을 위하여 80 ℃로 10분 동안 가열 후 동결 건조한 발효추출물을 DMSO에 희석하고 최종농도가 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ㎎/㎖이 되도록 실험을 진행하였다.

3) Nitric oxide 생성 농도 분석

RAW 264.7 세포에서 nitric oxide의 생성 억제 효과를 분석하기 위하여 24 well plate에 세포를 파종하고 며느리배꼽, 다시마, 톳, 미역, 모자반의 발효추출물의 최종 농도가 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ㎎/㎖이 되도록 처리하였다. 그리고 2시간 후 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하고 20시간 동안 다시 배양하여 염증을 유도하였다. Nitric oxide의 농도 분석을 위하여 100 μl의 배지 상등액과 동량의 Griess 시약을 섞고 10분간 실온에서 반응 후 550 ㎚의 파장에서 흡광도(BioTek Instruments Inc., Winooski, USA)를 측정하였다.

4) 세포독성 분석

RAW 264.7 세포와 B16F10 세포에 대한 해조류 발효 추출물의 독성은 기존 연구에서 사용했던 방법(Park & Yoon, 2023)과 동일하게 진행하였다.

5) In vitro tyrosinase 활성 분석

Tyrosinase 활성의 측정을 위하여 1.5 mM의 tyrosine(Sigma-Aldrich, USA)과 0.1 M의 potassium phosphate buffer에 희석한 2000 U/㎖의 mushroom tyrosinase를 준비하였다. 발효 추출물의 최종농도가 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ㎎/㎖이 되도록 준비하고 tyrosinase와 반응 후 tyrosine을 첨가하고 37 ℃에서 30분간 반응을 유도하였다. 양성대조군은 arbutin을 이용하였고 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

6) Melanin 생성량 측정

Melanin 생성량을 측정하기 위하여 B16F10 세포를 6 well plate에 파종 후 200 nM의 α-MSH와 시료를 농도별로 처리하였다. 72시간 후 1x PBS로 세포를 회수하여 1N NaOH로 90 ℃에서 1시간 동안 가열하여 세포를 용해한 후 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

2. 통계 분석

실험은 3회 반복하여 시행 후 SPSS 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., USA)을 이용하여 mean±SD로 결과 값을 표시하였다. 실험군 간의 유의성은 일원배치분산분석법(one-way ANOVA)으로 시행하였고 사후분석은 Duncan's multiple range test를 사용하였다.

Ⅲ. 결과

1. 해조류 발효추출물의 NO 생성 억제 효과와 세포독성

해조류 발효추출물이 RAW 264.7 세포와 B16F10 세포에 미치는 독성을 분석하기 위하여 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ㎎/㎖의 농도로 WST-1 assay를 진행한 결과 Fig 1에서 보는 것과 같이 RAW 264.7세포에서 톳과 미역 발효추출물은 처리한 농도에서 세포독성은 보이지 않았으나 다시마와 모자반은 1, 2 ㎎/㎖에서는 약한 독성을 나타냈다. 그리고 B16F10 세포에서는 RAW 264.7 세포에서 세포독성을 보였던 1, 2 ㎎/㎖ 농도에서 시료를 모두 처리한 결과 유의미한 세포독성은 발견되지 않았다(Fig 2). 또한 LPS 처리에 의해 유도된 염증에서 해조류 발효추출물의 NO 생성억제 효과를 분석한 결과 Fig 3에서 보는 것과 같이 0.5 ㎎/㎖에서 생성 억제 효과 보이기 시작하여 시험 농도 2 ㎎/㎖에서 가장 억제 효과가 높았다. 구체적으로 대조군 대비 톳 63.88 %로 가장 높은 억제효과를 보였고, 미역 61.38 %, 다시마 50.37 %, 모자반 47.28 %순으로 NO 생성을 억제하였으며, 농도 의존적 염증 억제 효과를 보였다.

Fig 1. Cytotoxic effect of agent treatment in LPS stimulated RAW 264.7 cells, S. japonica, Saccharina japonica; H. fusiforme, Hizikia fusiforme; U. pinnatifida, Undaria pinnatifida; S. fulvellum, Sargassum fulvellum

Fig 2. Inhibitory of NO production in LPS stimulated RAW 264.7 cells, LPS, lipopolysaccharide; S. japonica, Saccharina japonica; H. fusiforme, Hizikia fusiforme; U. pinnatifida, Undaria pinnatifida; S. fulvellum, Sargassum fulvellum

Fig 3. Cytotoxic effect of agent treatment in α-MSH stimulated B16F10 cells, α-MSH, α-melanocyte stimulating hormone; S. japonica, Saccharina japonica; H. fusiforme, Hizikia fusiforme; U. pinnatifida, Undaria pinnatifida; S. fulvellum, Sargassum fulvellum

2. 해조류 발효추출물의 Tyrosinase 활성 억제 효과

B16F10 세포에서 해조류 발효추출물이 멜라닌 합성에 미치는 효과를 확인하기 위하여 tyrosinase activity를 분석하였다. Tyrosinase는 L-tyrosine을 기질로 하여 L-3,4-dihyroxyphenylalanine(L-DOPA)를 생성하고, L-DOPA는 다시 tyrosinase에 의해 dopaquinone을 거쳐 melanin으로 합성된다(Ni 등, 2025). 본 연구에서는 melanin의 생성을 유도하기 위하여 기질인 L-tyrosine에 mushroom tyrosinase를 처리한 결과 양성대조군인 arbutin에 의해 85 % 가량 억제되는 결과를 보였다. 그리고 다시마에서 82.33 %로 가장 높은 tyrosinase 활성 억제 효과를 보였고, 톳 78.26 %, 모자반 26.71 %, 미역 21.63 %순으로 억제를 보여, 해조류 발효추출물 중 다시마와 톳은 효과적인 tyrosinase 억제 소재임을 알 수 있었다(Fig 4).

Fig 4. Tyrosinase inhibition rate of seaweed fermentation extracts treatment in α-MSH stimulated B16F10 cells, α-MSH, α-melanocyte stimulating hormone; S. japonica, Saccharina japonica; H. fusiforme, Hizikia fusiforme; U. pinnatifida, Undaria pinnatifida; S. fulvellum, Sargassum fulvellum

3. 해조류 발효추출물의 멜라닌 생성 저해 효과

B16F10 세포에서 해조류 발효추출물의 미백 효과를 확인하기 위하여 세포 내에서 생성되는 멜라닌 합성 능력을 분석하였다. 멜라닌의 생성을 유도하기 위하여 200 nM의 α-MSH를 처리했을 때, 음성대조군에 비해 유의적으로 멜라닌 합성이 증가된 것을 확인할 수 있었고, 특히 시료를 처리했을 때 네 종류의 시료 모두 멜라닌 합성을 억제하였으나 해조류 발효추출물의 종류에 따라 차이를 보였다. 멜라닌 생성이 미역이 83.56 %로 가장 많이 생성되었고, 모자반 82.87 %, 다시마 50.23 %, 톳 41.32 % 순으로 생성되어 다시마와 톳이 미역과 모자반보다 강한 멜라닌 생성 억제력을 보인 것으로 나타났다(Fig 5).

Fig 5. Melanin synthesis inhibition of seaweed ferementation extracts in α-MSH stimulated B16F10 cells, Synthesized melanin in B16F10 cells after seaweed fermentation extracts (A) The agents treated cells were lysed with 1 N NaOH and the absorbance was measured at 490 ㎚, (B) α-MSH, α-melanocyte stimulating hormone; S. japonica, Saccharina japonica; H. fusiforme, Hizikia fusiforme; U. pinnatifida, Undaria pinnatifida; S. fulvellum, Sargassum fulvellum

Ⅳ. 고찰

자외선 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 수행하는 멜라닌이 과다 생성되는 경우 기미, 주근깨가 발생할 뿐만 아니라 더 심한 경우 피부암이 유발되기도 한다(Brenner & Hearing, 2008). 멜라닌 세포의 tyrosinase가 기질인 L-tyrosine을 멜라닌으로 변환하는데 가장 중요한 역할을 하는 효소로 tyrosinase의 활성 억제는 미백 소재 개발의 유용한 평가방법으로 활용되고 있다(Ni 등, 2025). 본 연구에서는 해조류의 미백 생리 활성을 높이기 위하여 해조류 추출물을 김치유산균인 L. sakei를 이용하여 발효하였고, 발효추출물의 항염증능과 미백활성을 분석하였다.

해조류 발효추출물의 항염증능과 세포독성을 확인하기 위하여 Fig 1, 3에서 보는 것과 같이 RAW 264.7 세포와 B16F10 세포에서 독성을 확인한 결과, RAW 264.7 세포에서 고농도의 다시마와 참모자반은 약한 세포독성을 유발하였으나 그 외의 시료는 RAW 264.7 세포와 B16F10 세포 모두에서 유의미한 독성을 보이지 않았다. 그리고 RAW 264.7 세포에서 분석한 염증 억제능은 네 종류의 해조류 발효추출물은 유의적으로 LPS에 의해 유발된 NO의 생성을 억제하였고, 특히 톳과 미역은 다시마와 모자반보다 강한 항염증능을 보이는 것을 확인되었다. 이러한 해조류 발효추출물의 특성은 다양한 연구에서 분석되었고, 특히 다시마 물 추출물을 Lactobacillus brevis로 발효 후 항산화 및 항염증 활성을 분석한 Jung 등(2019)의 연구, 꽈배기모자반을 Lactobacillus sp. SH-1으로 발효 후 항염증능을 분석한 Lee 등(2016)의 연구, 다시마를 Saccharomyces cerevisiae와 Lactobacillus plantarum의 공서 배양으로 발효 후 항치주염증 효과를 분석한 Jung(2023)의 연구, 다시마와 톳을 Lactobacillus rhamnosus로 발효 후 항염증 기전을 분석한 Hwang 등(2017) 등 다수의 연구에서 뛰어난 생리활성을 나타냈다.

해조류 발효추출물의 tyrosinase 활성 억제 효과를 in vitro에서 분석한 결과 효소의 활성 억제 효과는 미역, 모자반, 톳, 다시마의 순으로 나타났고, B16F10 세포에서 해조류 발효 추출물의 미백 효과 분석을 위하여 세포에서 생성되는 멜라닌 합성 능력을 분석한 결과 α-MSH에 의해 유의적으로 증가된 멜라닌 합성이 시료의 처리에 의해 억제되었다. 특히, 시료간의 차이에 있어서는 미역과 모자반이 강하게 멜라닌 생성을 억제한 반면, 다시마와 톳은 다소 약한 활성을 나타내어 in vitro tyrosinase 결과와 같은 양상을 보였다. 해조류의 미백 활성은 다양한 소재에서 시도되었으나 발효추출물에 대한 미백 활성의 분석은 Kang 등(2018b)의 연구 이외에는 수행되지 않았다. 또한 Kang 등(2018b)의 연구에서는 미역, 다시마, 불등가사리 등의 해조류를 혼합 후 발효하여 추출물을 제조 후 항산화, 미백, 보습의 활성 분석을 시행하였고, 복합 발효추출물은 발효 전보다 높은 미백 활성이 나타난 것으로 보고하였다. 이는 발효 과정에서 다양한 유효 물질들의 농도가 높아졌기 때문이라 생각되며, 유효성분의 정량적 분석을 통하해 효과에 대한 객관성을 확보하기 위하여 추가적인 연구가 필요하다. 본 연구에서도 추후 어떤 물질들의 농도가 높아졌는지에 대한 분석이 필요할 것으로 사료되며, 이러한 결과를 토대로 다시마, 톳, 미역, 모자반의 발효추출물은 미백 기능성 화장품 원료로 사용할 가능성이 있을 것으로 생각된다.

Ⅴ. 결론

본 연구에서는 다시마, 톳, 미역, 모자반 추출물을 김치 유산균인 L. sakei를 이용하여 발효한 시료의 항염증능과 미백효과를 RAW 264.7 세포와 B16F10 세포를 이용하여 분석하였다. RAW 264.7 세포에서 높은 농도의 다시마와 모자반은 약한 세포독성을 보였으나 그 외의 시료는 두 세포주 모두에서 유의미한 독성이 확인되지 않았다. 그리고 네 종류의 해조류 발효추출물 모두 LPS에 의해 유발된 NO의 생성을 유의적으로 억제하였고, 톳과 미역은 다시마와 모자반보다 강하게 NO 생성을 억제하였다. 또한 in vitro tyrosinase 억제 효과와 B16F10 세포에서의 멜라닌 합성 조절능 모두 해조류 발효추출물의 처리에 의해 유의적으로 억제되는 결과를 확인하였다. 이 결과를 토대로 다시마, 톳, 미역, 모자반의 발효추출물은 미백 기능성 화장품의 원료로 사용할 가능성이 있을 것으로 생각된다.