Wound Healing Effect of Conditioned Medium from an Immortalized Adipose-derived Stem Cell Line by SV40 T Antigen

SV40의 T 항원으로 불사화한 지방줄기세포주로부터 생산된 배양액의 상처치료 효능

Abstract

Adipose-derived stem cells (ADSCs) are emerging as a new tool for wound-healing and skin-regeneration. Their main efficacy is due to the paracrine effects mediated by the secretory substances and many studies have focused on utilizing the conditioned medium (CM) derived from ADSCs. However, the limited lifespan and poor proliferative capacity of ADSCs during in vitro expansion hinder their extensive use in clinical applications. To overcome these growth disadvantages, we previously established an immortalized ADSC line (ADSC-T) by introducing the SV40 T antigen-coding gene into primary human ADSCs. In this study, we assessed the wound-healing and tissue-regeneration effects of CM derived from this cell line. The CM of ADSC-T promoted the growth and migration of rat fibroblast 3Y1 cells and strongly enhanced wound contraction in FPCL cultures. The CM elevated the phosphorylation of MAPKs, including ERK, p38, and JNK. AKT phosphorylation was also elevated by the CM. CM increased the production of growth factors such as VEGF, EGF, FGF, and TGF-β, as well as collagen 1A2, from 3Y1 cells. Furthermore, the CM exhibited antioxidant activity by scavenging DPPH free radicals. In an in vivo wound-healing test using C57BL/6N mice, the ADSC-T CM demonstrated a significant therapeutic effect. These results suggest that the immortalized ADSC-T line could be a versatile cell source for CM production with potential applications in wound-healing and tissue-regeneration.

지방줄기세포는 상처치료와 피부재생을 위한 새로운 방안으로 부각되고 있다. 지방줄기세포의 주된 효능은 지방줄기세포가 분비하는 물질에 의해 나타난다고 알려져 있으며 이로 인해 지방줄기세포의 배양액을 활용하고자 하는 연구가 주목받고 있다. 그러나 지방줄기세포는 수명이 짧고 증식 속도가 느려 임상 적용에 어려움이 있다. 선행 연구에서 본 연구팀은 지방줄기세포의 증식 능력 부족을 극복하기 위해 사람의 지방줄기세포에 SV40의 T 항원 유전자를 도입하여 불사화시킨 ADSC-T 세포주를 개발하였다. 본 연구에서는 ADSC-T 세포주로부터 생산한 배양액의 상처치료 및 조직 재생 효능을 평가하였다. 그 결과, ADSC-T 배양액은 쥐의 섬유아세포인 3Y1의 증식과 이동을 증가시켰으며, FPCL 배양에서 3Y1에 의한 상처 수축을 강하게 증가시켰다. 또한 ADSC-T 배양액은 ERK, p38, JNK를 포함한 MAPKs뿐 아니라 AKT의 인산화도 증가시켰다. ADSC-T 배양액은 3Y1 세포로부터 VEGF, EGF, FGF, TGF-β의 생산과 collagen 1A2의 생산을 증가시켰으며 DPPH 활성 산소를 제거하는 항산화 효과를 보였다. C57BL/6N 쥐를 사용한 생체 실험에서 ADSC-T 배양액은 우수한 상처치료 효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 불사화된 ADSC-T가 상처치료 및 조직 재생을 위한 배양액 생산에 적합하여 널리 이용될 수 있음을 의미한다고 볼 수 있다.

1. 서론

피부는 체내의 근육과 기관을 보호하는 조직으로 다양한 세포로 구성되어 있으며 외부의 유해 환경을 차단하는 보호 장벽을 형성하고 유지한다. 그러므로 피부 상처의 조속한 치료는 감염을 예방하고 신체의 기능 유지에 필수적이라 할 수 있다[16, 26]. 상처 치유는 단계적으로 진행되는데 상처 발생 후 지혈(hemostasis)이 일어나면 면역세포에 의해 감염원이 제거되는 염증(inflammation) 단계, fibroblast (섬유아세포)의 증식과 이동이 증가하고, 세포 외 기질(extracellular matrix)의 축적과 함께 상처 부위를 축소하는 상처 수축(wound contraction) 단계, 상처 부위의 상피화(re-epithelialization)와 신생혈관이 형성되는 증식(proliferation) 단계, 축적된 collagen이 교차 결합하면서 흉터 조직으로 바뀌는 성숙 및 재형성(remodeling) 단계를 거친다[33, 37]. 그러나 이러한 단계는 세포 외적 환경에 의해 많은 영향을 받아 상처 치료 기간이 길어지거나 염증 반응이 지속되는 등 치료에 어려움을 겪는 경우가 많이 발생한다. 특히 당뇨환자와 고령자에서 이러한 어려움이 많이 발생한다[19, 28, 41].

상처 치료 과정에는 세포의 증식을 촉진하는 다양한 성장인자(growth factor)와 염증 및 세포 증식을 조절하는 cytokines가 필요하며 이러한 성장인자와 cytokines의 균형적 작용이 조속한 상처 치료에 중요한 요소로 알려져 있다[3, 15, 34, 35]. 최근에는 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)의 분비물(secretome)을 함유하고 있는 ADSC의 배양 상등액(conditioned medium, CM)에 많은 종류의 성장 인자와 cytokines가 함유되어 있고, 이 CM이 상처 치료에 탁월한 효과를 나타낸다는 연구 결과가 많이 보고되고 있어 ADSC의 CM을 상처 치료제로 활용하고자 하는 연구가 ADSC의 새로운 연구분야로 부각되고 있다[7, 12, 30]. 현재 지방줄기세포의 수급은 환자 본인의 지방조직에서 분리하거나 성형외과에서 비만 치료를 목적으로 흡입하여 폐기되는 흡입 지방을 환자의 동의를 얻어 수거하여 줄기세포를 분리하여 사용한다. 그러나 ADSC는 세포의 증식속도가 느리고 세포의 수명이 짧아 공여자로부터 반복적인 채취가 필요하고 폐기되는 지방조직에서 세포를 분리하여 사용하기에는 세포 수가 매우 부족한 상황이며, 다수의 공여자로부터 흡입한 지방조직을 모아서 사용할 경우 세포 성질의 차이, 바이러스 등 질병 전염의 위험성, 윤리적 문제 등으로 세포 수급에 많은 문제점을 가지고 있다[11, 24, 36].

본 연구팀은 선행 연구에서 이러한 ADSC의 세포 수급 문제를 해결하기 위해 ADSC에 simian virus 40 (SV40)의 T 항원 유전자를 도입하여 불사화(immortalization)시킨 지방줄기세포주를 개발하여 ADSC-T라 명명하였으며, 이 세포주가 primary ADSC에 비해 증식속도가 향상되고 세포 수명이 연장되었음을 보고한 바 있다[22, 23, 25]. 또한, ADSC-T는 지방줄기세포의 분화 능력을 보유하고 있으며 ADSC-T의 무혈청 CM은 높은 항염증 효능을 가지고 있어 염증 치료제 및 화장품의 원료로 활용 가능함을 보고한 바 있다[25]. 본 연구에서는 ADSC-T를 배양하여 생산한 무혈청 CM의 상처 치료 효능 및 조직 재생 효능을 검토하여 ADSC-T CM을 원료로 한 상처 치료제 의약품 및 피부 재생 기능성 화장품의 개발 가능성을 평가하고자 하였다.

2. 재료 및 방법

2.1 세포배양 및 ADSC-T로부터 무혈청 CM의 생산

CM의 효능 평가에 rat fibroblast 세포인 3Y1을 사용하였으며 배양은 fetal bovine serum (FBS)이 10% 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. ADSC-T 세포주로부터 무혈청 CM의 생산은 10%의 FBS를 함유한 DMEM 배지를 이용하여 100 mm plate에 cells/ml의 ADSC-T 세포를 투입하여 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12로 배지를 교체하여 72시간 배양한 후 배양 상등액을 수거하고 0.2 μm bottle top filter (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 여과하여 CM으로 사용하였다. FBS, DMEM, DMEM/F12, PBS는 Gibco BLR Co. (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.

2.2 MTT assay

96 well plate에 3Y1 세포를 cells/ml로 seeding 하여 24시간 동안 배양한 후 DMEM/F12 또는 ADSC-T CM으로 교체하여 24시간 추가 배양하고, PBS에 녹인 0.5 mg/ml thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) solution을 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 상등액 제거 후 dimethylsulfoxide (DMSO)를 처리하고 침전물을 녹인 후 microplate reader (EZ Reader 4000, Biochrom, Cambridge, UK)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식 정도(%)는 CM에서 배양한 세포의 흡광도를 DMEM/F12에서 배양한 세포의 흡광도로 나눈 값으로 산정하였다.

2.3 Fibroblast-populated collagen lattice (FPCL) contraction assay

Collagen solution을 제조하기 위하여 collagen type1 (Nitta Gelatin Ltd., Osaka, Japan), 5× DMEM (Gibco), reconstitution buffer를 7:2:1의 비율로 혼합하였다. Reconstitution buffer는 0.05 M NaOH, 2.2% NaHCO₃, 200 mM HEPES (pH 7.5)를 함유하였다. 3Y1 세포를 collagen solution 1.5 ml에 첨가한 후 30 mm plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 30분간 배양하여 응고된 collagen의 가장자리를 주사 바늘을 이용하여 plate 벽으로부터 떼어준 후 50% DMEM/F12 또는 50% ADSC-T CM을 함유한 DMEM을 첨가하여 8일간 배양한 후 Image J 프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA)으로 분석하였다.

2.4 Western blotting

시료 단백질을 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 90 V로 2시간 동안 nitrocellulose membrane (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 electrotransfer 한 뒤 5% 탈지분유를 포함한 TBS-T (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액으로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. Membrane을 1차 항체와 실온에서 2시간 반응시키고 TBS-T 용액으로 3번 세척한 후 peroxidase-conjugated 2차 항체로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응시킨 membrane을 TBS-T 용액으로 3번 세척한 후 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA)로 발광시킨 후 Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 이용하여 결과를 확인하였다. 항체는 anti-p-ERK (sc-7383), anti-ERK (sc-514302), anti-p-JNK (sc-6254), anti-JNK (sc-7345), anti-p-p38 (sc-166182), anti-p38 (sc-7972), anti-p-Akt (sc-514032), anti-Akt (sc-81434), anti-COL1A2 (sc-8788), anti-β-actin (sc-47778) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)을 제조사의 사용법에 따라 사용하였다.

2.5 RT-PCR

세포를 PBS로 2회 세척한 후, Trizol (Santa Cruz Biotechnology) 용액으로 처리하여 total RNA를 분리하고 Accupower Roketscript cycle RT premix (Bioneer Corp., Daejeon, Korea)을 이용하여 cDNA를 제작하였다. PCR 반응은 94℃ 3분동안 predenature 하고, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 35 cycle 거친 후, 72℃ 10분으로 완료하였다. RT-PCR의 결과는 2.5% agarose gel로 전기영동하여 확인하였다. 사용한 primer는 Table 1과 같다.

Table 1. Primer sequences for RT-PCR

F, forward; R, reverse

2.6 DPPH scavenging assay

에탄올에 용해시킨 0.15 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA) 용액을 96 well plate에 100 μl씩 분주하고 DMEM/F12 또는 ADSC-T CM을 100 μl씩 첨가하여 10분 및 20분간 암실에서 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.

\(\begin{align}\text {DPPH radical scavenging activity}(\%)=\frac{A b s_{D F}-A b s_{C M}}{A b s_{D F}} \times 100\end{align}\)

Abs_DF : absorbance of DMEM/F12

Abs_CM : absorbance of ADSC-T CM

2.7 생체 상처치료 효능 검토

생체 내 상처치료 효능 검토를 위하여 마우스를 이용하였다. 생후 4주령 암컷 C57BL/6N 마우스를 같은 생활 조건에서 사육하였으며 마우스용 사료와 멸균된 물을 자유롭게 공급하고 실험실 환경에 일주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 동물실험 윤리 가이드를 준수하였다(승인 번호 창원대학교 2024-05). 마우스 등의 털을 완전히 제거한 후 척추를 중심으로 등의 피부를 당겨서 좌우 피부를 겹치게 한 후 6 mm punch를 이용하여 동일한 크기와 깊이의 전층피부 결손창을 형성시키고 다음 날부터 매일 동일한 시간에 7일간 왼쪽 부위의 상처에는 30% 및 50%의 ADSC-T CM을 도포하고 오른쪽 부위의 상처에는 30% 및 50%의 DMEM/F12를 도포하였다. 30% 및 50% 각 3마리씩 사용하였다.

2.8 통계 처리

실험은 3회 반복하였고, 결과는 Graphpad prism 5 (GraphPad Software, Boston, MA, USA)를 이용하여 평균(mean) ±표준편차(SD)로 나타내었다. One way ANOVA와 t-test를 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다. p 값이 0.05 이하면 유의성이 있다고 판단하였다.

3. 결과

3.1 ADSC-T CM의 fibroblast 증식 및 이동 촉진 효과

ADSC-T의 무혈청 CM의 상처치료 효능을 평가하기 위하여 fibroblast의 증식(proliferation)과 이동(migration)에 미치는 CM의 영향을 검토하였다. 조직에 상처가 발생하면 fibroblast가 증식하고 상처 부위로 이동이 일어난다[39, 40]. 이 과정에서 fibroblast는 상처 부위의 세포 외 기질(extracellular matrix)의 성분과 상처치료에 필요한 다양한 성장인자 및 cytokines를 공급한다[29, 31, 37, 40]. Fibroblast의 증식과 이동은 상처치료 초기 단계에 필수적으로 일어나며 fibroblast의 증식 및 이동 촉진 효과는 상처치료 촉진 효과로 나타난다. 먼저 ADSC-T CM의 fibroblast 증식 촉진 효과를 검토하기 위하여 rat fibroblast 세포인 3Y1 세포를 이용하여 MTT assay를 실시하였다. MTT assay는 세포의 mitochondria의 succinate dehydrogenase에 의해 환원되어 생성된 formazan을 측정하여 세포의 생장 및 증식 촉진을 확인하는 실험방법이다. 96 well plate에서 DMEM 배지로 배양한 3Y1 세포를 DMEM/F12 기본배지 또는 ADSC-T CM으로 교체하여 24시간 배양한 후 MTT 용액을 처리하였다. 그 결과, DMEM/F12에서의 세포 성장률에 비하여 ADSC-T CM에서는 36.5%가 증가하였다(Fig. 1A). 이 결과로부터 ADSC-T CM은 fibroblast의 증식을 촉진하는 효과를 가짐을 알 수 있었다. 다음은 ADSC-T CM에 의한 fibroblast의 이동 촉진 효과를 검토하기 위하여 scratch wound healing assay를 실시하였다. 3Y1 세포를 100% confluency 상태로 배양하여 monolayer를 형성시키고 멸균된 micropipet tip을 이용하여 scratch를 낸 후, 50%의 DMEM/F12 기본배지 또는 50%의 ADSC-T CM을 함유한 DMEM으로 교체하였다. 48시간 배양 후 사진 촬영 및 Image J와 Prism 5 프로그램을 사용하여 wound closure를 확인하였다. 그 결과, CM을 함유한 배지로 배양한 세포가 DMEM/F12를 함유한 배지로 배양한 세포보다 활발히 증식 및 이동하여 scratch가 메꾸어짐을 확인하였다(Fig. 1B top and middle panel). 또한, 48시간 배양 후 scratch 가장자리 부위의 세포를 현미경 관찰한 결과 DMEM/F12보다 CM을 함유한 배지에서 활발하게 세포가 이동하고 있는 것을 알 수 있었다(Fig. 1B lowest panel). 아울러 세포의 이동 거리를 측정한 결과 DMEM/F12를 함유한 배지에서는 24시간에 370 μm, 48시간에 817 μm 이동한 반면, CM을 함유한 배지에서는 24시간에 730 μm, 48시간에 1,123 μm 이동하여 CM의 3Y1 세포 이동 촉진 효과가 우수함을 알 수 있었다(Fig. 1C).

Fig. 1. Effect of ADSC-T CM on the proliferation and migration of fibroblast cell. (A) Rat fibroblast 3Y1 cells were cultured in DMEM/F12 or ADSC-T CM for 24 hr and MTT assay was performed (mean ± SD, n=3, *p<0.01, **p<0.001). (B) Monolayer cultures of 3Y1 cells in 100 mm plates were scratched with a micropipette tip and cultured with DMEM containing 50% DMEM/F12 or 50% ADSC-T CM for 48 hr. The lines on the pictures indicate the boundaries of the scratches (top and middle panels). The cells at the edges of the scratches were photographed (bottom panel). (C) The migration distance was measured using the Image J program (mean ± SD, n=3, *p<0.01, **p<0.001).

3.2 ADSC-T CM의 상처 수축 촉진 효과

상처치료 초기 과정에서 상처 부위로 이동한 fibroblast는 상처 부위에 collagen, fibronectin, hyaluronan, proteoglycan 등의 세포 외 기질 물질을 생산하여 축적하며 pseudopodia를 확장하여 collagen과 fibronectin을 연결하여 상처를 수축시킨다[2, 31, 37]. 이 과정은 상처 부위를 축소시키고 상처 부위의 경계를 형성하는 단계로 치료 기간 단축을 위해 중요하다. 그러므로 ADSC-T CM의 상처 수축 효과를 검토하기 위하여 3Y1 세포를 사용하여 fibroblast-populated collagen lattice(FPCL) 배양법을 실시하였다[10, 13]. 이 방법은 상처 수축 작용을 in vitro에서 측정하는 방법으로 lattice 내에 collagen과 fibroblast를 혼합하여 배양하면 fibroblast가 collagen과 연결되어 네트워크를 형성하여 증식하면서 lattice를 수축시키는 현상을 이용하는 것이다. 3Y1 세포를 함유한 collagen lattice를 30 mm plate에서 50% DMEM/F12 기본배지 또는 50%의 ADSC-T CM을 첨가한 DMEM 배지에서 8일간 배양한 결과 배양 시작일에 7.07 cm²였던 lattice 면적이 DMEM/F12 첨가 배지에서는 4.40 cm²로 수축하였고, ADSC-T CM 첨가 배지에서는 1.84 cm²로 수축되어 ADSC-T CM이 강한 상처 수축 효과를 가짐을 알 수 있었다(Fig. 2A upper panel, Fig. 2B). 또한 8일간 배양 후 lattice 내의 3Y1 세포를 현미경으로 관찰한 결과 CM을 첨가하여 배양한 3Y1 세포가 DMEM/F12를 첨가하여 배양한 세포보다 활발한 네트워크를 형성하여 증식하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 2A lower panel).

Fig. 2. Effect of ADSC-T CM on the contraction of collagen lattice by 3Y1 cells. (A) cells of 3Y1 in collagen lattice were cultured with DMEM containing 50% DMEM/F12 or 50% ADSC-T CM for 8 days, and the lattices (upper panel) and the cells in the lattices (lower panel) were photographed. (B) The areas of lattices were measured using Image J program (mean ± SD, n=3, *p<0.01)

3.3 ADSC-T CM의 MAPKs 및 AKT 활성화 효과

위에서 ADSC-T CM은 상처치료에 중요한 요소인 fibroblast의 증식과 이동을 촉진시킴을 알 수 있었다(Fig. 1). 이러한 사실은 CM이 fibroblast 내의 세포 증식과 관련된 신호전달 회로를 활성화시킬 가능성이 있음을 시사한다고 볼 수 있다. 그러므로 세포 증식과 밀접한 연관성이 있는 MAPKs와 PI3K/AKT 신호전달 회로에 대한 CM의 영향을 검토하였다. MAPKs는 ERK, JNK, p38을 포함하며 이들의 활성화는 세포 증식, 분화, 생존을 증가시키는 것으로 알려져 있다[27, 32]. 또한 PI3K에 의해 활성화되는 AKT도 세포 증식을 촉진하여 상처치료에 도움을 준다는 보고가 다수 발표되어 있다[20, 32]. 3Y1 세포를 50% DMEM/F12 기본배지 또는 50%의 ADSC-T CM을 첨가한 DMEM 배지에서 24시간 배양한 결과 ERK, JNK, p38의 발현량에는 차이가 없었으나 인산화된 p-ERK, p-JNK, p-p38은 CM의 첨가에 의해 현저하게 증가되어 CM에 의해 MAPKs 회로가 활성화됨을 알 수 있었으며 이러한 결과를 반복된 실험으로 확인하였다(Fig. 3A‒3C). 또한 AKT의 경우도 CM의 첨가에 의해 AKT의 발현량에는 변화가 없었으나 인산화된 p- AKT는 현저하게 증가하여 AKT가 CM에 의해 활성화됨을 알 수 있었으며 반복된 실험에서 같은 결과를 확인하였다(Fig. 3D). 이 결과로부터 ADSC-T CM은 fibroblast의 세포 증식과 관련된 MAPKs 및 AKT 회로를 활성화함으로써 fibroblast의 증식과 이동을 촉진하고 상처치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Fig. 3. Activation of MAPKs and AKT by ADSC-T CM. 3Y1 cells were cultured with DMEM containing 50% DMEM/F12 or 50% ADSC-T CM for 24 hr, and each protein was detected by Western blotting.

3.4 ADSC-T CM의 성장인자(growth factor) 생산 촉진 효과

상처치료 과정에는 다양한 성장인자가 관련한다[28, 37]. 상처 발생으로 인해 증식이 촉진되어 상처 부위로 이동한 fibroblast는 상처 부위에 성장인자를 공급하는 주된 세포이다[29, 37]. 상처치료에 중요한 역할을 하는 성장인자에는 상처 부위의 신생혈관을 형성하여 조직재형성(remodeling)에 관여하는 vascular endothelial growth factor (VEGF) [14], 표피세포의 증식과 분화 및 진피의 collagen 생산을 촉진하는 epidermal growth factor (EGF) [6], 신생혈관 생성과 fibroblast의 증식 및 분화를 유도하여 상처치료를 촉진하는 fibroblast growth factor (FGF) [17], fibroblast의 증식과 분화 및 세포 외 기질의 생산을 촉진하는 transforming growth factor β(TGF-β) [5]가 있다. ADSC-T CM이 fibroblast에 의한 이들 성장인자의 생산을 촉진하는 효과를 가지는지 검토하기 위해 3Y1 세포를 50% DMEM/F12 또는 50%의 ADSC-T CM을 함유한 DMEM 배지에서 24시간 배양 후 성장인자의 mRNA 양을 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과, VEGF, EGF, TGF-β가 CM에 의해 발현이 현저하게 증가하였으며 FGF도 소량 증가함을 반복 실험을 통해 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이로부터 ADSC-T CM은 fibroblast의 성장인자 생산을 증가시켜 상처치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Fig. 4. Effect of ADSC-T CM on the expression of growth factors in 3Y1 cells. 3Y1 cells were cultured with DMEM containing 50% DMEM/F12 or 50% ADSC-T CM for 24 hr and the mRNA levels were measured by RT-PCR. GAPDH was used as an internal control.

3.5 ADSC-T CM의 collagen 생산촉진 효과 및 항산화 효과

Fibroblast에 의해 생산되는 collagen은 결합조직의 주성분으로 상처치료의 모든 단계에서 중요한 역할을 한다[4, 6, 8]. 특히 치료 초기의 fibroblast 이동(migration)에 필요하며, 상처 수축(wound contraction) 단계에서 fibroblast와 연결되어 상처 부위를 축소하는 역할을 하며, 상처치료 마지막 단계에서 상처가 흉터로 전환되는 성숙 및 재형성(remodeling) 단계에서도 중심적인 역할을 한다[1, 37]. 그러므로 상처 부위의 collagen 생산 증가는 상처치료 기간 단축과 치료의 효율을 높일 수 있다. ADSC-T CM이 fibroblast에 의한 collagen 생산량을 증가시키는 효과가 있는지 검토하기 위해 3Y1 세포를 50% DMEM/ F12 또는 50%의 ADSC-T CM을 함유한 DMEM 배지에서 24시간 배양 후 세포 내 collgen type 1A2의 발현량을 검토하였다. 그 결과, DMEM/F12를 첨가하여 배양한 세포보다 CM을 첨가하여 배양한 세포에서 collagen1A2의 전구체와 성숙형 모두 높은 발현량을 나타내었다(Fig. 5). 이 결과로부터 ADSC-T CM은 fibroblast의 collagen 생산을 촉진하여 상처치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 한편, 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 의한 산화적 스트레스는 다양한 세포의 손상을 초래하며, 특히 피부의 fibroblast, keratinocyte 및 endothelial cell은 ROS에 의해 손상을 많이 받으며 이로 인해 상처치료가 지연된다는 보고가 다수 이루어졌다[21, 43]. 그러므로 ADSC-T CM이 항산화(anti-oxidant) 효과를 가지는지 검토하기 위하여 DPPH free radical 소거능력을 측정하였다. DPPH 용액과 DMEM/F12 또는 ADSC-T CM을 동량 섞어 10분 및 20분간 반응시킨 결과 Fig. 6에 나타난 바와 같이 DMEM/ F12는 10분 반응에서 36.19%, 20분 반응에서 29.29%의 free radical 소거능을 나타낸 반면 CM은 10분 반응에서 47.14%, 20분 반응에서 58.33%의 소거능을 보여 CM에 항산화 물질이 함유되어 있음을 알 수 있었다.

Fig. 5. Effect of ADSC-T CM on the expression of collagen by 3Y1 cells. 3Y1 cells were cultured with DMEM containing 50% DMEM/F12 or 50% ADSC-T CM for 24 hr and the collagen 1A2 was detected by Western blotting.

Fig. 6. DPPH free radical scavenging activity of ADSC-T CM. DMEM/F12 or ADSC-T CM was mixed with an equal volume of 0.13 mM DPPH and incubated for 10 min and 20 min in dark room. The radical scavenging activity was calculated from the OD at 515 nm (mean ± SD, n=3, *p<0.05).

3.6 ADSC-T CM의 in vivo 상처치료 효과

위에서 본 바와 같이 ADSC-T CM은 fibroblast의 증식과 이동을 촉진하고 강한 상처 수축 촉진 기능을 가지며, fibroblast의 증식과 상처치료 작용을 촉진하는 세포 내 MAPKs 및 AKT 신호전달 회로를 활성화 시킬 뿐 아니라 상처치료에 필요한 성장인자와 collagen 생산을 증가시키고 항산화 작용도 나타내었으므로 강한 상처치료 효과가 있을 것으로 추측할 수 있다. 이러한 작용이 실제로 in vivo에서 상처치료 효과로 나타나는지 검토하기 위하여 C57BL/6N 마우스를 이용하여 상처치료 효과를 검토하였다. 마우스에 인위적인 상처를 유발하고 30% 및 50%의 CM 또는 DMEM/F12를 7일간 매일 상처 부위에 도말한 결과 Fig. 7에 나타난 바와 같이 4일째부터 30%와 50% 농도 모두에서 CM을 도포한 왼쪽 상처가 DMEM/F12를 도포한 오른쪽 상처보다 작아졌으며 도포 7일째에는 CM을 도포한 쪽의 상처는 거의 치료된 반면 DMEM/F12를 도포한 쪽은 병변이 뚜렷이 남아있는 것을 확인할 수 있었으며 이러한 결과는 사용한 마우스 모두에서 유사하게 나타났다. 이 결과로부터 ADSC-T CM은 in vivo에서 우수한 상처치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Fig. 7. Wound healing effect of ADSC-T CM in C57BL/6N mice. After removing the hairs on the backs of C57BL/6N mice, artificial wounds of the same size were made on both sides of the spine using a 6 mm punch, and then 200 μl of 30% or 50% ADSC-T CM was applied to the left wound and 200 μl of 30% or 50% DMEM/F12 (D/F) was applied to the right wound for 7 days.

4. 고찰

지방줄기세포(ADSC)는 다양한 재생(regeneration) 기능을 가지고 있어 상처치료, 피부재생, 항염증, 발모 효과 등이 탁월한 것으로 알려져 있고 피부의 노화 방지, 탄력증가, 미백효과도 우수하여 의약품 및 화장품 분야에서 광범위한 활용이 가능하다[7]. 최근에는 이러한 ADSC의 생물학적 기능이 ADSC가 분비하는 분비물(secretome)에 함유되어 있는 성장인자와 cytokines에 의한 paracrine effect임이 다수 보고되면서 ADSC의 분비물이 함유되어 있는 배양 상등액(conditioned medium, CM)을 활용하고자 하는 연구가 주목을 받고 있다[9, 18, 38]. 그러나 CM을 생산하기 위하여 ADSC를 배양할 경우 세포 증식 속도가 다른 세포에 비해 느리고 빠른 배양 쇠퇴(culture senescence) 현상으로 세포 수명이 짧아 다량의 세포가 필요하며, 이로 인한 세포 수급 문제가 ADSC의 실용화에 가장 큰 문제점으로 남아있다[18, 36]. 이러한 세포 수급 문제를 해결하는 방법으로 primary ADSC를 세포주(cell line)로 전환시키는 불사화(immortalization)를 이용할 수 있다. 그러나 세포를 불사화할 경우 세포의 특징이 암세포에 근접할 가능성이 있으며 줄기세포의 경우 가장 중요한 특징인 분화 능력을 상실할 수 있고 생물학적 기능도 변화할 가능성이 있으므로 주의가 필요하다. 이러한 관점을 고려하여 본 연구팀은 선행 연구에서 인체에 암을 비롯한 어떠한 질병과 부작용을 일으키지 않는 것으로 알려진 SV40의 T 항원 유전자를 사람의 primary ADSC에 도입하여 불사화시킨 세포주 ADSC-T를 개발하였으며, 이 세포주가 ADSC의 분화 능력을 유지하고 있으며 ADSC-T의 CM이 강한 항염증 효능을 나타냄을 보고한 바 있다[22, 23, 25]. 본 연구에서는 ADSC-T CM의 상처치료 및 조직 재생 효능을 평가하였으며, CM은 상처치료 과정에서 가장 중요한 역할을 담당하는 fibroblast의 증식과 이동을 촉진하였고 fibroblast에 의한 상처 수축을 강하게 증가시켰다. 또한 ADSC-T CM은 유사분열을 촉진하며 세포 증식을 증가시키는 것으로 알려진 MAPKs (ERK, p38, JNK)를 활성화시키는 것으로 나타났으며[27, 42] ERK와 함께 상처치료를 촉진하는 것으로 알려진 AKT도 활성화하는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 ADSC-T CM은 fibroblast의 VEGF, EGF, FGF, TGF-β의 생산을 촉진하였다. 이들 성장인자는 상처치료에 관여하는 대표적인 성장인자로 알려져 있으며 VEGF는 혈관신생 작용[14], EFG는 표피의 증식과 분화 촉진 및 진피의 collagen 생산을 촉진하여 상처치료 및 피부의 탄력을 증가시키고[6], FGF는 상처치료 효과에 더하여 주름 예방, 두피 탈모 예방, 노화 방지의 효과가 있으며[17], TGF-β는 세포 외 기질과 collagen 생산을 촉진하고 상피세포의 성장과 이동을 증가시켜 상처 치유뿐 아니라 피부미용에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다[5]. 또한 ADSC-T CM은 fibroblast에 의한 collagen 생산을 촉진하는 것으로 나타났으며 collagen은 상처치료에 작용할 뿐 아니라 피부의 보습과 탄력을 유지하고 뼈와 연골 강화 효능이 있으며, 나이가 들수록 체내 collagen 생산이 감소하므로 ADSC-T CM은 피부미용 및 노화 방지 효과도 우수할 것으로 예상된다[1, 19]. 이와 더불어 ADSC-T CM은 조직의 광범위한 손상을 초래하고 상처 치유를 방해할 뿐 아니라 노화를 일으키는 활성산소(ROS)를 제거하는 항산화 물질을 함유하고 있는 것으로 나타나 상처치료와 노화 방지 기능이 우수할 것으로 예상된다[21, 43]. 또한 ADSC-T CM은 C57BL/6N 마우스를 이용한 in vivo 상처치료 효능 검토에서도 우수한 상처 치료 효과를 나타내었다. 이전 연구에서 보고한 바와 같이 ADSC-T CM은 강한 항염증 효과를 가지고 있으므로 ADSC-T CM을 활용하면 상처치료와 항염증 효능을 겸비한 상처 치료제를 개발할 수 있을 것이다. 현재 상처치료에 사용되고 있는 대부분의 의약품이 감염 예방 효과만 있고 상처치료는 자연 치유에 의존하거나 상처치료 효과가 있더라도 항염증 효과는 없는 경우가 많아 항염증제를 별도로 사용해야 하는 점으로 미루어 볼 때 치료 효과와 항염증 효과를 겸비한 ADSC-T CM은 우수한 상처 치료제 원료로 활용할 수 있으며 재생, 미백, 노화 방지의 기능성 화장품 원료로도 활용이 가능할 것이다. 또한 CM에 함유되어 있는 효능 물질의 대부분은 엑소좀 내에 존재하는 것으로 알려져 있으므로 엑소좀을 분리하여 농축한다면 고효능 상처 치료제의 개발도 가능할 것이다. 본 연구에서 CM의 재생 효과가 세포 내 MAPKs 회로의 활성화와 성장인자 생산 촉진과 연관 있는 것으로 나타났으므로 관련 연구를 확대한다면 줄기세포의 재생 효능에 대한 분자기전의 규명으로 이어질 수 있을 것이며, 이러한 연구에 ADSC-T 세포주는 유효한 줄기세포 연구 재료로 활용될 수 있을 것이다.

감사의 글

본 연구는 2025-2026년도 창원대학교 지원연구비에 의해 수행된 것이며 이에 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.