본 실험에서는 HRF의 조절단백질을 알아보기 위해 HRF를 bait로 한 yeast two hybrid assay를 실행한 결과 해당과정에 관여하는 TPI(triosephosphate isomerase)라는 효소를 발견하였으며, 가장 많이 중복되어 있었다. In vitro에서 HRF는 TPI의 C말단 잔기 부근(아미노산 156-249)이 상호작용에 주로 관여하는 부위임을 알 수 있었다. 또한, HeLa 세포에서 immunoprecipitation을 이용하여 HRF와 TPI의 상호작용이 실제 in vivo에서도 일어나는 현상이라는 것을 밝혔다. 결과적으로 HRF와 TPI 상호작용은 세포내 일정량이 존재하며 여러가지 신호전달에 의해 동시에 Na,K-ATPase와도 상호작용하는 것으로 생각된다.
본 실험에서는 MRF가 다량 존재하는 RBL-2H3 세포주에 다양한 PKC isotype별 억제제를 처리하여 in vitro상에서 Na, K-ATPase $\alpha$1L3를 이용한 pull-down assay와 RBL-2H3 세포를 이용한 membrane fractionation을 실시하였다. 그 결과 HRF는 in vitro에서 $\alpha$1L3와 결합한다는 사실을 재확인 할 수 있었고 실제 세포주 내에서 Na,K-ATPase와 결합한다는 것을 알 수 있었다. 사용한 약물로부터 PKC $\alpha,\;\beta,\;\delta$뿐 아니라 protein phosphatase 2B(PP2B)도 HRF와 $\alpha$1L3의 결합에 관여한다는 사실을 알 수 있었다. 또한 이들 PKC, PP2B에 의해 인산화된 HRF 분자는 cytosolic fraction으로 이행할 수 있으며 이러한 결과는 탈인산화된 HRF가 Na,K-ATPase와 결합하여 Na, K-ATPase의 기능을 조절한다고 추정할 수 있다. 그러나 약물자체가 histamine 분비에 영향을 미칠 수 있으며 cytosolic HRF보다 exocytosis된 HRF가 histamine를 더 분비하도록 할 수 있으므로, 약물을 전처리한 세포에 외부에서 HRF를 첨가하여 histamine이 유리되는 정도가 어떻게 변화하는지를 HRF를 가하지 않은 결과와 비교해야 할 것이다.
RBL-2H3 cell lysates에 anti-protein phosphatase(PP) 1, 2A, 2B 항체를 첨가한 후 immunoprecipitation을 실시한 결과 PP2B를 가해준 샘플에서만 HRF를 확인하였다. 역으로 monoclonal anti-HRF 항체를 가한 후 immunoprecipitation을 실시한 결과 PP1, 2A는 검출되지 않았으나 PP2B의 경우는 regulatory subunit(19 kDa), catalyic subunit(60 kDa) 모두 확인할 수 있었다. Affinity chromatography를 통해서도 PP2B가 HRF의 탈인산화에 관여함을 확인하였다 즉 19kDa의 PP2B regulatory subunit과 60kDa의 catalytic subunit 모두가 확인되었으며 외부 $Ca^{2+}$이온 첨가 여부에 따른 차이는 관찰할 수 없었다. 결론적으로 RBL-2H3 cell에서 PP2B는 PP1이나 PP2A에 비해 상대적으로 그 존재량은 적으나 HRF와 상호작용하는 phosphatase로서 검출된 반면 PP1이나 PP2A는 검출되지 않았다.
HRF는 Na,K-ATPase의 ${\alpha}$ subunit에 결합하여 이의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있으며, PKC에 의해 Ser98 잔기가 인산화 될 수 있다는 것을 anti-HRFpS98 항체와 HRF S98A mutant를 이용한 실험으로 확인할 수 있었다. 또한 $^{86}Rb^{+}-uptake$ assay 실험에서 HRF의 serine 98 잔기의 탈인산화는 Na,K-ATPase의 활성에 약간의 영향을 미치는 것으로 미루어 PKC에 의해 인산화되는 98 serine 잔기가 Na,K-ATPase 활성 저해에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
IgE-dependent histamine-releasing factor (HRF) is found extracellularly to regulate the degranulation process of histamine in mast cells and basophils and known to play a predominant role in the pathogenesis of chronic allergic disease. HRF has been also identified in the intracellular region of the cell. Previously, we reported that HRF interacts with the 3rd cytoplasmic domain of the alpha subunit of Na,K-ATPase and inhibits Na,K-ATPase activity. Since it is known that estroaen activates the sarcolemmal Na,K-ATPase, we tested whether estrogen recovers the Na,K-ATPase activity repressed by HRF. In this study, we showed that estrogen activates Na,K-ATPase repressed by HRF. RT-PCR and western blot analysis showed that estrogen doesn't reduce the expression level of HRF in HeLa cell, suggesting that this recovery effects of estrogen probably occur via indirect mechanism on HRF and Na,K-ATPase.
The effect of biofertilizer (compound of microbial inoculants or groups of micro-organisms) on growth and yield of rice was investigated. The experiment was carried out in a randomized complete block design with 3 replications and 7 treatments namely: $RF=N-P_2O_{5-}K_2O$ (11-5.5-4.8 kg $10a^{-1}$); half of the recommended fertilizer rate, $HRF=N-P_2O_5-K_2O$ (5.5-2.75-2.4 kg $10a^{-1}$); HRF+Bio 250=HRF combined with 250 kg biofertilizer $10a^{-1}$; HRF+Bio 500=HRF combined with 500 kg biofertilizer $10a^{-1}$; Bio 250=250 kg biofertilizer $10a^{-1}$; Bio 500=500 kg biofertilizer $10a^{-1}$; and NF = No Fertilizer. Results showed that the recorded values of plant height, tiller number and chlorophyll content at 40 to 60 days after transplanting (DAT) in HRF+Bio 500 were significantly higher than those recorded in the RF treatment. Similar observations between these two treatments were only recorded from 60 DAT onwards. Yield components were also superior in HRF+Bio 500 treatment and comparable to that of RF. The highest grain yield obtained in HRF+Bio 500 treatment (785.8 kg $10a^{-1}$) was statistically similar to that of RF (739.8 kg $10a^{-1}$) but significantly higher than that of NF (506.7 kg $10a^{-1}$). Finally, head grain recovery (90.9) was low while chalkiness (0.03) was high at HRF+Bio 500 treatment as compared with RF, which were (96.1) and (0.3), respectively. Results showed that combined treatment of HRF and 500 kg biofertilizer $10a^{-1}$ has similar effects on the growth and yield of rice with that of RF.
The effect of biofertilizer in enhancing nutrient quality and antioxidant property of rice grain was investigated. The experiment was carried out in a randomized complete block design with 3 replications and 7 treatments namely : RF = $N-P_2O_5-K_2O(11-5.5-4.8kg\;10a^{-1});$ half of the recommended fertilizer rate, $HRF=N-P_2O_5-K_2O(5.5-2.75-2.4kg\;10a^{-1}):$ HRF+Bio 250=HRF combined with 250 kg Biofertilizer 10 $a^{-1}$; HRF+Bio 500=HRF combined with 500 kg Biofertilizer 10 $a^{-1};$ Bio 250=250 kg Biofertilizer 10 $a^{-1};$ Bio 500=500 kg Biofertilizer 10 $a^{-1};$ and NF=No Fertilizer. Results showed that HRF+Bio 500 obtained a significantly higher protein content but a significantly lower amylose content compared with RF and NF treatments. Highest phytic acid content was recorded in NF treatment while the lowest was observed in HRF+500 treatment. The highest values in both electron donating ability and reducing power were obtained in HRF+Bio 500 treatment. All treatments obtained higher reducing power than that of the RF treatment and that NF treatment showed comparable values in both electron donating ability and reducing power with those of the treated plots. Highest antimutagenicity property was also observed in HRF+Bio 500 treatment followed by Bio 500 treatment. This study showed the possibility of using biofertilizer to enhance nutritional quality and antioxidant property of rice.
RBL-2H3 cell에서 HRE에 의하여 histamine이 분비되는 과정에서 ROS가 생성되는지 실험해 본 결과, ROS가 HRF를 처리한지 5분대에 최대치를 보이며 생성되었다가 소멸되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 HRF가 세포내 second messenger로써의 ROS를 생성하였다고 확인할 수 있었다. 또한 ROS는 단백질 정제 과정에서의 endotoxin오염에 의해 영향을 받지만,본 실험에서 규명한 HRF에 의한 ROS 생성은 endotoxin에 의한 것이 아닌, 순수하게 HRF에 의한 signaling의 결과라는 것도 확인할 수 있었다.
A field experiment was conducted to investigate effects of application time and rate of biofertilizer alone and in combination with chemical NPK fertilizer on growth, yield and quality of rice. The biofertilizer used composted food waste as substrate and added with effective microorganism. The treatments included recommended NPK fertilizer(RF, $11-5.5-4.8kg\;10a^{-1}$), half recommended NPK fertilizer(HRF, $5.5-2.8-2.4kg\;10a^{-1}$), half recommended NPK fertilizer plus $250kg\;10a^{-1}$ biofertilizer(HRF+Bio 250) and $500kg\;10a^{-1}$ biofertilizer(HRF+Bio 500). The biofertilizer treatments were applied at 0, 5 and 10 days before transplanting(DBT). Grain yield of HRF+Bio 250 at 5 DBT($648.4kg\;10a^{-1}$) was statistically similar to the highest obtained in the RF($654.1kg\;10a^{-1}$). Tiller numbers at HRF plus biofertilizer treatments were already high during the maximum tillering stage, and were similar with that of the RF and higher than that of the HRF during heading stage. Likewise, ripening ratio at HRF plus biofertilizer treatments was similar with that of the RF and higher than that of the HRF. Furthermore, all the biofertilizer treatments improved protein content but reduced the amylose content and palatability compared to treatments with chemical NPK fertilizer alone. Thus, HRF+Bio 250 at 5 DBT can be used to save 50% chemical NPK fertilizer and at the same time obtain an improved rice grain yield and quality.
Horizontal root fracture (HRF) is a result of trauma to teeth and periodontium, which implies severe injury to cementum, dentin, and pulp. This is a rare case of HRF in the maxillary lateral incisor of a 62-year-old male who only presented persistent gingival swelling, fistula, and dull pain at first. An apical radiolucency of unknown origin turned out to be a result of hidden HRF at the coronal third level that was later visualized radiographically during endodontic treatment. The tooth was scheduled to be extracted upon the patient's agreement. The purpose of this report is to alert clinicians about the importance of diagnosing HRF through thorough clinical and radiographic examinations. Where there is persistent fistula without proper cause, HRF should be considered as a causative factor, and the diagnosis could be effective with aid of cone beam computed tomography, electronic root apex locator, as well as other clinical signs.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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