Tetracycline계 약제가, 류마치양 관절염을 비롯한 염증성 질환들의 주된 병인으로 알려지고있는 호중구 elastase의 활성도를 억제하였으며, 특히 oxytetracycline, demeclocycline, 그리고 tetracycline 등은 분자 구조적 차이에 따라 elastase의 효소 활성도에 대하여 다양한 억제율을 나타내었다. 측쇄 구조의 5번 위치에 $OH{^-}$기가 첨가된 oxytetracycline이 가장 높은 억제율을 나타내었다. 억제 양상에 있어서도 tetracycline이 비경쟁적 저해 형태를 보인 반면에, oxytetracycline은 경쟁적 저해 형태를 나타내었으며, Ki값은 각각 4.9mM과 0.39mM로 산출 되었다. 또한 항균 효과를 나타내는 활성 부위를 제거시킨 de-dimethylaminotetracycline을 합성하여 효소 활성도 억제 실험에 사용한 결과, tetracycline과 유사한 효소 억제 작용을 나타냄을 확인하였다. 이상의 연구 결과에서, tetracycline의 효소 활성도 억제 작용은 항균 효과를 나타내는 활성 부위와 상관없이 독립된 기전에 의해서 일어나는 약리 작용이며, 측쇄 구조의 $OH{^-}$기가 이 작용에 영향을 주는 일부 원인인 것으로 추정할 수 있으며, 이를 tetracycline계 약제가 염증 부위에서 나타내는 분자 단계에서의 새로운 약리 기전으로 제시하고자 한다. 또한 de-dimethylaminotetracycline은 항균제의 장기 사용시에 발생할 수 있는 저항균의 출현과는 무관하므로, 다른 부작용에 대한 연구가 선행될 경우, elastase에 의해 야기되는 만성 질환들의 치료제로써 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
사람 혈액속의 elastase와 관련된 질병에 대한 연구는 다양한 저해제의 개발을 동반해 왔으며, 최근 항생제도 그 관심대상이 되고 있다. 두 단계의 액체 크로마토그래피를 거쳐 얻은 고순도의 elastase에 12종의 항생제를 처리하였다. 세포벽합성 저해제로 알려져 있는 penicillin계와 cephalosporin계 항생제를 각각 3종씩 처리한 결과, methicillin과 cefamandole은 10mM 농도에서 elastase 활성을 50% 이상 저해하였지만, 나머지는 거의 10% 미만이었다. 단백질합성 저해제 중 oxytetracycline의 elastase에 대한 저해효과는 10mM 농도에서 95% 이상으로 매우 탁월하였으며 $(IC_{50}=0.3mM)$, gentamicin도 50% 이상 저해하였으나, 다른 aminoglycoside나 chloramphenicol은 역시 10%미만이었다. 실험해 본 항생제 가운데, oxytetracycline, cefamandole, methicillin, gentamicin 등은 elastase에 대한 강력한 저해제였으며, 그 작용기전은 항생제의 알려진 약리학적 기전과는 다른 차원의 모델임이 분명하였다.
염증 질환의 원인이 되는 사람 중성구 elastases는 혈액에 존재하는 ${\alpha}_1-PI$나 ${\alpha}_2-macroglobulin$과 같은 단백질 분해효소 억제제에 의하여 조절되어진다. 그러나 특수한 병리적 상황에서 과다하게 분비되는 효소나 또는 단백질 분해효소 억제제의 비정상적 작용으로 말미암아 다양한 염증질환이 유발된다. 비스테로이드성 항염증제는 염증 질환을 치료하기 위하여 이미 임상에 적용 하고 있으며, prostaglandin 합성하는 효소인 cyclooxygenases의 활성도를 억제하는 것이 그 작용 기전으로 잘 알려져 왔다. 사람 중성구 elastase의 활성도는 naproxen, phenylbutazone, oxyphenbutazone 등에 의하여 억제되었으나, ibuprofen, ketoprofen, aspirin, salicylic acid, tolmetin 등에 의하여서는 억제되지 않았다. 또한 사람 중성구 elastase의 활성도는 EDTA, EGTA, tetracycline 등에 의하여서도 억제되었다. EDTA에 의하여 2가 이온 $Ca^{++}$나 $Zn^{++}$등을 elastase 분자로부터 일부 제거함으로 효소 활성도가 억제되었고 Raman spectra의 변화도 강하게 일어났으며, 금속이온 $Zn^{++}$를 새로 충진함으로 그 활성도는 원래대로 회복되고 Raman spectrum도 원래 상태와 유사한 상태로 회복되었다. 이런 현상은 chelator나 chelator-like agents가 효소분자안에 존재하는 $Zn^{++}$ 이온을 제거하거나 chelation함으로 활성 부위나 그 인접 부위의 4차원 구조의 변화를 일으켰음에 기인하며 특히 -C=O나 -COOH기의 관여에 의한 것으로 생각된다.
Human neutrophil elastase (HNElastase, EC 3.4.21.37), a causative factor of inflammatory diseases, was purified by Ultrogel AcA54 gel filtration and CM-Sephadex ion exchange chromatography. HNElastase was inhibited by phenylbutazone in a concentration dependent manner up to 0.4 mM, but as the concentration increased, the inhibitory effect gradually diminished. Binding of phenylbutazone to the human neutrophil elastase caused strong Raman shifts at 200, 440, and 1194 $cm^{-1}$. The peak at 1194 $cm^{-1}$ might be evidence of the presence $of\;-N=N-{\Phi}$ radical. The core area of the elastase, according to the visual molecular model of human neutrophil elastase, was structurally stable. A deeply situated active center was at the core area surrounded by hydrophobic amino acids. Directly neighboring the active site was one positively charged atom and two atoms carrying a negative charge, which enabled the enzyme and the drug to form a strong interaction. Phenylbutazone may form a binding, similar to a key & lock system to the atoms carrying opposite charges near the active site of the enzyme molecule. Furthermore, the hydrophobicity of the surrounding amino acid near the active site seemed to enhance the binding strength of phenylbutazone. Binding of phenylbutazone near the active site may cause masking of the active site, preventing the substrate from approaching the active site and inhibiting elastase activity.
사람의 혈액으로부터 Elastase를 분리하는 새로운 방법을 개발하여 순도 높은 효소를 얻고 이 효소에 의하여 발생되어지는 질병의 예방과 치료에 응용하기 위하여 이 효소의 근본적인 성질규명을 시도하였다. 정제 방법으로는 Sephodex G-75를 이용한 1회의 액체 크로마토그라피와 HPLC을 이용한 2회의 코마토그라피를 거치는 2단계 방법을 사용하였다. 이때 얻어진 효소는 분자량이 $26,000{\sim}29,700$ 사이에 있는 3개의 다른 분자량을 가진 물질로 확인되었으며, 항체 반응에서 사람의 결구내 Elastase의 특성을 나타내었다. 함유하고 있는 미량의 금속이온을 분석한 결과 정제하는 단계에 따라 Zn 이온의 효소분자에 대한비는 증가하였으며 가장 순수한 분자내의 효소분자와 Zn 이온과의 비는 1 : 2였다. 이 효소는 chelating agent에 의하여 활성도를 잃게 되었으며, 반대로 chelating agents에 의하여 활성도를 잃고 있는 반응 medium에 그 chelaing agents의 농도를 초과하는 2가 이온 즉 Zn 이온, Ca 이온, 그리고 Mn 이온을 넣으면 그 활성도는 원상복귀되나 Mg이온에 의하여는 그 활성도가 원상회복 되지 않았다. 이 모든 성질을 종합하면 사람의 Neutrophil granule에 있는 Elastase는 지금까지 알려진 바와 같이 Serine pretense임과 동시에 metalloenzyme으로 제고되어야 한다고 제안한다. 나아가서chelating agents에 의하여 이 효소의 활성도를 조정할 수 있다는 것은 이 효소에 의하여 일어나는 질병의 치료에 응용할 수 있는 가능성도 보여준다.
Kim, Kwan-Chul;Kim, Dae-Jung;Lee, Myung Sun;Seo, Ji Yun;Yoo, Ick-Dong;Lee, Ik-Soo
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제28권11호
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pp.1806-1813
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2018
A new sesquiterpene lactone dimer [1], together with five known compounds (2-6), was isolated from the flowers of Inula britannica. The structures of these compounds were established by extensive spectroscopic studies and chemical evidence. The inhibitory activities of these isolated compounds (1-6) against human neutrophil elastase (HNE) were also evaluated in vitro; compounds 1 and 6 exhibited significant inhibitory effects against HNE activity, with $IC_{50}$ values of 8.2 and $10.4{\mu}m$, respectively, comparable to that of epigallocatechin gallate (EGCG; $IC_{50}=10.9{\mu}M$). In addition, compounds 3 and 5 exhibited moderate HNE inhibitory effects, with $IC_{50}$ values of 21.9 and $42.5{\mu}M$, respectively. In contrast, compounds 2 and 4 exhibited no such activity ($IC_{50}$ > $100{\mu}M$). The mechanism by which 1 and 3 inhibited HNE was noncompetitive inhibition, with inhibition constant ($K_i$) values of 8.0 and $22.8{\mu}M$, respectively.
The pancreatic and neutrophil elastases are associated with several illnesses including lung and vascular diseases, various cancers, and pancreatitis. The development of a potent and specific inhibitor to the elastases could lead to new therapies. In this study, an agar diffusion method was modified to include a substrate-dye conjugate (Elastin-Congo red) as a substrate of elastase and an indicator of elastase inhibitory activity. The Elastin-Congo red agar plates consisted of 0.1 % Elastin-Congo red and 2.5% agar. The elastase and elastase inhibitors were simultaneously loaded into wells, ultimately resulting in halo formations in which the halo diameter decreased as the concentration of elastase inhibitor increased. The concentration of elastase inhibitor in the samples, therefore, was inversely proportional to the halo diameters. This simplified method provided an excellent correlation with the standard microplate technique, which uses a chromogenic substrate. The concentration of elastase inhibitor obtained from the culture supernatant of a recombinant elastase inhibitor produced by the yeast Pichia pastoris was easily determined. This study has established a simple modified and inexpensive agar diffusion method that is potentially useful for the identification, quantification, and screening of new elastase inhibitors.
Elastase (EC 3. 4. 4. 7)는 구조 단백질인 fibronectin, collagen 그리고 elastin을 포함한 다양한 단백질들을 분해한다. Elastase는 생체 염증 방어의 중요한 성분이며, $\alpha$$_1$-proteinase inhibitor ($\alpha$$_1$PI)와 같은 생체 내부에 있는 단백질 분해 효소 저해제들에 의해 조절된다. 그러나, 만성 염증의 결과, elastase와 $\alpha$$_1$PI 사이의 균형이 elastase 쪽으로 기울어지면 조직 파괴가 일어나게 된다. 본 연구자들은 이미 피부의 진피내에서 백혈구로부터 과다하게 분비되는 elastase를 저해하는 물질을 찾기 위하여, 150 여가지의 한방식물 추출물에 대해 elastase 저해활성을 스크리닝 (screening) 하여, 빈랑 (Areca catecheu) 추출물이 가장 높은 저해활성을 보여줌을 확인하였다. 본 연구에서는 유효성분을 찾기 위하여 빈랑을 90% 에탄올로 추출한 다음, 다양한 용매를 사용하여 분획하였고, 각 분획에 대해 elastase 저해활성을 측정하였다. 이 중 저해 활성이 뛰어난 분획은 silica gel 컬럼 크로마토그래피, Preparative TLC 그리고 역상 HPLC를 실시하였다. 역상 HPLC에서 elastase 저해 활성이 있는 peak은 성분을 확인할 수 있는 여러 가지 정색 반응과 UV, IR 스펙트럼을 통하여 phenol 성 물질임을 확인하였다. 빈랑으로부터 정제한 phenol 성 물질은 돼지 췌장 elastase (Porcine pancreatic elastase : PPE)와 사람 백혈구 elastase (Human neutrophil elastase ; HNE)에 대한 $IC_{50}$/ 값이 각각 26.9 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$과 60.8 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로서, 기존에 elastase의 저해제로 알려진 oleanolic acid (각각 76.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 219.2 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)와 ursolic acid (각각 31.0 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 118.6 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)에 비하여 더 우수한 저해 활성을 나타내었으며, PPE와 HNE에 대하여 기질과 경쟁적으로 반응함을 알 수 있었다. 또한 빈랑으로부터 정제한 phenol 성 물질이 염증 과정 중에 발생하는 free radical을 소거할 수 있는지를 조사한 결과, free radical을 50% 소거시키는 농도값이 6 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 표준물질인 비타민 C (19 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)나 butylated hydroxyl toluene (18.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)보다 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 mast cell내에서 활성화되며 hyaluronic acid를 분해하는 hyaluronidase에 대한 저해를 조사한 결과, $IC_{50}$/ 값이 210 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로서 효과적인 저해 활성을 나타내었다 따라서, 본 연구에서 빈랑으로부터 분리한 phenol 성 물질은 피부 결합 조직을 구성하는 단백질들을 보호함으로써 피부 노화를 억제하는 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
Background: Statins can regulate the production of pro-inflammatory cytokines and inhibit MMP production or activation in a variety of types of cells. This study evaluated whether statins would inhibit MMP release from human lung fibroblasts, which play a major role in remodeling processes. Methods: This study, using an in-vitro model (three-dimensional collagen gel contraction system), evaluated the effect of cytokines (tumor necrosis factor-${\alpha}$, TNF-a and interleukin-$1{\beta}$, IL-1b) on the MMP release and MMP activation from human lung fibroblasts. Collagen degradation induced by cytokines and neutrophil elastase (NE) was evaluated by quantifying hydroxyproline. Results: In three-dimensional collagen gel cultures (3D cultures) where cytokines (TNF-a and IL-1b) can induce the production of MMPs by fibroblasts, it was found that simvastatin inhibited MMP release. In 3D cultures, cytokines together with NE induced collagen degradation and can lead to activation of the MMP, which was inhibited by simvastatin. Conclusion: Simvastatin may play a role in regulating human lung fibroblast functions in repair and remodeling processes by inhibiting MMP release and the conversion from the latent to the active form of MMP.
천연물로부터 새로운 기능성 화장품 소재를 개발하기 위하여 국내외 천연물을 대상으로 항산화 활성을 평가한 결과, 가시연꽃의 종자 추출물이 우수한 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 가시연꽃 종자의 추출물로부터 유효 성분을 분리하기 위하여 각종 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC 등의 기법을 실시하여 순수하게 정제된 화합물 5종을 획득하였다. 각종 NMR 및 MS 스펙트럼 등을 분석하여 이들의 화학구조를 규명한 결과 fucosterol (1), 3-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)-4-[(7'R),5'-dihydroxy-3'-methoxybenzyl]tetrahydrofuran (2), resorcinol (3), pyrogallol (4) and 4-O-methylgallic acid (5)로 동정하였다. 이들 화합물의 화장품 원료로서의 특징을 조사하고자 각 화합물들을 대상으로 항산화 활성, 엘라스타아제 저해활성, 미백활성 등을 평가하였다. 이들 화합물의 자유라디칼소거활성은 $SC_{50}$ 값이 $17.0\;{\sim}\;100.2\;{\mu}M$이었고, 특히 화합물 4 및 5는 양성대조구인 ferulic acid보다 6배 이상 강력한 활성을 나타내었다. 또한 엘라스타아제 저해활성에 대한 $IC_{50}$ 값은 $18.8\;{\sim}\;78.2\;{\mu}M$로써 특히 화합물 4는 양성대조구인 EGCG와 비슷한 활성을 나타내었으며, B16F10 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 저해활성에 대해 화합물 3은 양성대조구인 arbutin보다 약 2배 이상 강력한 미백활성을 나타내었다. 따라서 가시연꽃 종자 추출물은 강력한 항산화활성, 엘라스타아제 저해활성 및 미백활성을 나타내는 유효성분들을 다량 함유하므로, 복합 기능성을 나타내는 화장품 원료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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