Effects of Persimmon leaf on the Photoaging Skin Improvement(1)

감잎의 광노화 피부 개선에 미치는 효과(1)

Abstract

This study was performed to investigate the anti-photoaging effects of Persimmon leaf tea(PLT) in hairless mice(SKH-1) exposed to UVB irradiation. The animals were divided into non-treated group (normal, N) and UV-radiated groups. UV-radiated groups were divided into only UV-radiated group(control, C) and UV-radiated and PLT treated experimental groups[first extraction treated group(PLT-I), second extraction treated group(PLT-II), and third extraction treated group(PLT-III)]. Three PLT treated experimental groups of mice were treated with both oral administration(300 mg/Kg B.W./day) and topical application (100 ul of 2% conc./mouse/day) for 4 weeks. Anti-photoaging effects of Persimmon leaf were evaluated by anti oxidative reaction, stereomicroscopic and microscopic observations. The expression of photoaging skin related factors including mast cell tryptase, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular endothelial growth factor (VEGF) was examined by immunohistochemical staining. Treatment of PLT-I, -II, -III prevented the wrinkle formation as well as epidermal hyperplasia, inflammatory cells, disruption of collagen in photoaged skin induced by UVB radiation. It also reduced the PCNA and VEGF expression in the UVB irradiated dorsal skin. Furthermore, it significantly decreased the number of mast cells in the UVB irradiated dermis(p<0.05 and p<0.01). On the effects of oxidative stress and antioxidant function on the treatment with water extract from Persimmon leaf tea(PLT), the activity of superoxide dismutase(SOD) was significantly increased in PLT-III group(p<0.05), and catalase(CAT) was significantly increased in PLT-I and PLT-III groups(p<0.05), and PLT-II group(p<0.001). These extracts showed relatively antioxidant activity and protective effect on UVB-induced oxidative stress in hairless mice(SKH-1). Our results suggest that Persimmon leaf tea may serve as an useful radical scavenging antioxidant and anti-photoaging skin agents in the UVB irradiated skin.

서 론

노령인구가 증가하면서 노화에 대한 관심이 높아지고 있으며, 특히 여성의 피부노화를 방어하는 기전과 그 기전에 효과가 있는 물질에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 이러한 추세에 맞춰 여성들의 화장품에 대한 기호가 점점 고기능화, 천연물질 함유, 부작용의 최소화에 대한 관심이 높아져가고 있다1). 피부노화의 원인에는 생리적, 환경적 여러 메카니즘이 작용하는데 특히 환경적 요인 중 광노화에 대한 영향이 주요 원인중 하나로 알려져 있다2). 태양광선중 자외선은 피부에 주름, 색소침착, 갈색반점 및 피부를 두껍게 한다3). 자외선은 피부의 각질세포와 섬유아세포를 활성화시켜 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 만들어 세포소기관들을 산화시킨다4). 이러한 ROS는 피부세포의 기질금속 단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMPs)를 증가시켜 교원섬유와 탄력섬유의 합성 결핍으로 피부에 주름을 생성한다5). 자외선은 진피층을 손상시켜 콜라겐섬유의 붕괴6)와 비정상적인 엘라스틴(elastin)이 함유된 물질을 축적하고7), 생화학적으로는 typeI과 typeⅡ collagen의 전구체인 풋아교질(procollagen)을 감소시킨다8).

최근의 피부노화 연구는 유기합성에 의한 비타민유도체나 천연물 소재에서 추출한 기능성 물질을 hairless mice나 인체피부세포(HaCaT)를 이용하고있다9). 상기 언급한 물질들은 자체가 매우 불안정하거나 용량에 따라 피부에 강한 자극을 일으키고, 사람의 체질에 따라 과민 반응을 일으킬 수 있어 피부노화 개선을 위한 최근의 연구 동향은 천연물질에서 유래한 기능성 소재를 찾고 있으며10-12), 부작용이 적고 천연 식물성 생리활성 물질로 피부노화 억제 기능을 가진 물질을 찾기 위한 국내 연구도 활발히 진행되고 있다13-15).

차류는 천연물 유래 항산화물질인 polyphenol류와 flavonoid류의 다양한 생리활성16)을 물질을 가지고 있는데 특히 감잎은 flavonoids의 강한 항산화 작용과 항암작용, 체내 지방저하17), 카페인, 수용성 탄닌, 비타민 C, 아미노산 등의 함량이 높으며18), 수용성 타닌은 활성산소의 free radical을 억제하는 효과와 ACE(angiotensin-converting enzyme)활성 저해작용이 있는 것으로 알려져 있다19,20). 차류 추출물의 항산화 작용은 활성산소에 의한 지질의 과산화반응을 억제하고 또한 금속이온에 대한 봉쇄역할을 하며, 그 주된 작용인자는 polyphenol류가 관여하는 것으로 추정하고 있다21).

그러므로 본 연구는 천연소재에서 항산화 기능을 갖고 있는 감잎의 피부 노화예방 및 조절을 확인하기 위해 hairless 마우스에 반복적인 UVB를 조사하여 광노화 피부를 유발시킨 후 감잎 열수추출물을 경구투여 및 도포를 하여 피부조직내 항산화 작용과 조직학적 변화 등을 관찰하여 피부노화 개선 효과에 대한 유효성을 알아보고자 하였다.

 

재료 및 방법

1. 시료 조제

감잎 추출물은 건조한 감잎 500 g을 70℃의 따뜻한 물 2 L에 20분간 담구어 우려낸 것을 감잎 추출물 I군(persimmon leaf tea, PLT-I)으로 하였고, 1차로 추출한 후 다시 70℃의 따뜻한 물 2 L에 담구어 우려낸 것을 감잎 추출물 Ⅱ군(PLT-Ⅱ)으로 하였다. 최종적으로 2차 추출 후 다시 70℃의 따뜻한 물 2L에 담구어 우려낸 것을 감잎 추출물 Ⅲ군(PLT-Ⅲ)으로 하였다. 각각의 회수한 감잎 추출액은 여과하여 감압건조기에서 농축하고 동결건조하여 최종 수득물을 회수하였다. 회수한 시료인 PLT-I은 77.3 g(수율, 15.5%)을, PLT-Ⅱ는 44.9 g(수율, 9.0%)을, PLT-Ⅲ은 9.6 g(수율, 1.9%)을 회수하였다.

2. 실험동물 및 처치

본 실험에 사용한 7주령, 수컷, hairless 생쥐(SKH-1 hairless 생쥐)는 오리엔트바이오에서 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 항온항습(22±2℃, 65±2% RH)하에서 사육하였고, 사료는 시판하는 고형사료를 공급하였다. 실험동물은 5개 군으로 분류하여 군별로 5마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 동물실험은 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인(WS2012-008)을 받아 실시하였다. 모든 실험군은 정상군, 대조군, 조건을 달리하여 추출한 감잎 추출물 투여군(3군)으로 나누었다. 정상군은 아무런 처치도 하지 않았으며, 대조군은 생리식염수 투여 후 무시료 도포액인 기본로션(vehicle)만을 도포하였다. 감잎 추출물 투여군은 각각 회수한 감잎 동결건조물 300 mg을 10 ㎖의 증류수에 용해하여 300 mg/Kg B.W. 용량으로 1일 1회 경구 투여하였다. 각 실험군의 감잎추출물 도포액은 에탄올, 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 증류수를 각각 30:20:50(v/v/v)의 비율로 잘 혼합한 기본로션에 감잎 동결건조물을 2% 농도(1 g/50 ㎖)로 첨가하여 제조한 후 1일 1회 도포액 100 ㎕를 hairless 생쥐의 귀에서 등부위 전체에 도포한 후 잘 문질러준 후 1시간 후에 UVB를 등부위에 조사하였다. 실험이 종료된 후 실험동물을 마취한 후 조직을 절취하여 일부는 Bouin,s solution과 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 광학 및 면역조직화학적 염색에 사용하였다.

3. 실험 방법

1) 피부 최소홍반도 측정

피부 최소홍반도를 측정하기 위하여 20W UVB lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)에서 조사한 자외선 강도가 0.3 mW/cm2가 되도록 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정하여 조사 높이를 정한 후 최소홍반량(minimal erythema dose)을 결정하였다. 최소홍반량은 hairless 생쥐의 등에 1×1㎠의 넓이로 소구획을 나눈 후 UVB를 30 mJ/㎠에서 80 mJ/㎠까지의 조사량을 10 mJ/㎠ 간격으로 조사하였다. UVB 조사 후 24시간이 경과한 후에 경계가 분명하고 네 모서리가 뚜렷한 홍반을 보이는 가장 낮은 광량인 60 mJ/㎠을 최소홍반량으로 정하였다.

2) 피부노화 유발 및 시료 도포

자외선 조사장치는 실험실에서 자체 제작한 캐비넷 내에 20W Ultraviolet B(UVB) lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)를 부착한 후 조사한 광원을 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정한 후 UVB 강도(intensity)가 0.3 mW/cm2가 되는 높이에서 조사하였다. 실험동물의 UVB 조사는 아크릴로 제작한 조사틀에 실험군 별로 각각의 생쥐를 가둔 후 생쥐의 등부위가 노출되도록 위쪽은 철망을 부착하였다. UVB 조사량은 최초 1주간은 1 MED(minimal erythema dose)에 해당하는 60 mJ/㎠를 1주에 5회(200초)씩 조사하였고, 2주는 120 mJ/㎠(400초), 3주는 180 mJ/㎠(600초), 4주는 240 mJ/㎠(800초)로 1주에 5회씩 조사하여 총 4주간 실시하였다.

3) 피부조직의 형태학적 관찰

(1) 육안적 관찰

피부의 육안적 관찰은 실험 4주째 Avertin으로 가볍게 마취를 한 후 SILFLO (Flexico developments LTD. Tokyo, Japan) silicone rubber impression material로 등쪽 피부주름의 replica를 제작하여 stereomicroscope로 촬영한 후 주름의 양상을 실험군별로 비교 관찰하였다.

(2) 광학현미경 관찰을 위한 피부조직의 일반 및 특수염색

절취한 피부조직을 실온에서 Bouin,s solution에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀에 포매하고 7 ㎛ 두께로 절편을 만들어 일반적인 조직학적 구조를 관찰하기 위하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하여 광학현미경으로 피부조직의 변화를 관찰하였다. 또한 특수염색으로는 진피층 내 교원섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 광학현미경으로 관찰하기 위하여 Masson’s trichrome 염색과 Van Giesson 염색을 시행하여22) 진피층 내의 교원섬유의 변화, 소실 및 퇴행성 변화 등을 관찰하였다. 진피층 및 피하층 내 비만세포(mast cell)의 분포양상 및 탈과립 정도를 관찰하기위하여 toluidine blue 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰한 후 200배 시야에서 출현된 비만세포의 수를 개수하였다.

(3) 피부조직의 면역조직화학적 염색

피부 조직내 사이토카인, 효소 및 수용체에 대한 면역조직화학적 변화를 관찰하고자 피부조직을 절취한 후 Bouin solution에 24시간 고정한 후 일반적인 방법으로 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 7 ㎛의 두께로 절단한 후 100% methanol에 0.3% H2O2를 넣은 용액에서 endogeneous peroxidase를 제거하였다. 그 후 비특이적인 면역반응을 제거하기 위하여 30분간 정상혈청(normal serum, 1:50)으로 처리하였다. UVB조사 후 변화가 있을 것으로 예상되는 mast cell tryptase (1:400, abcam, USA), proliferating cell nuclear antigen (PCNA, 1:100, Santa Cruz, CA, USA), vascular endothelial growth factor (VEGF, 1:50, Santa Cruz, CA, USA)를 1차 항체로 이용하였다. 1차 항체의 희석배율은 구입한 회사에 따라 차이가 있으므로 각각의 항체에 대한 positive control test를 실시하여 적정한 항체 희석 배율을 정한 후 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차항체는 1차항체 반응 후 5분간 3회 0.1 M PB로 수세과정을 거친 후에 Hsu 등23)의 방법에 따라 biotinylated anti-IgG(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 1:200으로 희석한 후 실온의 moisture chamber에서 30분 반응시켰다. 다시 5분간 3회 0.1 MPB 수세과정을 거친 후 peroxidase가 표지된 ABC 용액에서 30분간 반응시켰다. 그 후 다시 0.1 M PBS로 15분간 2회 수세하고 30 mg의 3-3' diaminobenzidine를 150 ㎖의 0.1 M PBS에 녹인 용액에서 5분간 반응시킨 후 과산화수소를 0.005% 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 15분간 시행하였다. 반응이 끝난 조직들은 통상적인 방법에 따라 탈수와 투명화를 거친 후 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

4) 조직내 유해산소 대사 활성도 측정(In vivo)

(1) 효소시료의 조제

일정량의 피부조직에 4배량의 0.25M sucrose 용액을 넣고 glass teflon homogenizer를 이용하여 마쇄균질액을 만들었다. 이 균질액을 600 × g 에서 10분간 원심분리한 후 핵 및 미 마쇄부분을 제거한 상층액을 취하여 10,000 × g에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 효소활성도 측정에 사용하였다.

(2) 피부조직의 유해산소 대사 효소활성도 측정

① Superoxide dismutase (SOD)

Rhie 등25)의 방법에 따라 UVB를 조사한 생쥐 피부조직을 0.25 M sucrose 용액을 넣고 lysis시킨 후, 피부 조직내 SOD 활성을 측정하기 위해 SOD determination kit (Sigma-Aldrich Inc., USA)를 사용하였고, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였다. SOD 활성측정은 96 well plate에 각 시료를 20 ㎕를 넣고 희석 buffer로 희석한 WST working solution을 200 ㎕ 넣-은 후 20 ㎕의 Enzyme working solution을 혼합하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 측정한다. SOD농도는 bovine erythrocytes의 superoxide dismutase(Sigma-Aldrich Inc., USA) 표준물질을 사용하여 계산하였다.

② Catalase (CAT)

CAT 활성도는 Rhie 등24)의 방법에 따라 UVB를 조사한 생쥐 피부조직을 SOD 측정과 동일한 buffer(0.25 M sucrose)를 넣고 lysis시킨 후, 조직내 CAT 활성을 측정하기 위해 catalase assay kit (Sigma-Aldrich Inc., USA)를 사용하였고, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였다. lysate 10 ㎕에 assay buffer 65㎕를 넣고 25㎕의 colorimetric assay 기질용액을 잘 혼합하여 5분간 실온에서 반응시킨다. 5분 후 반응을 중지시키기 위해 stop solution을 넣고 이 반응물 10 ㎕에 color reagent 1㎖을 넣은 후 실온에서 최소 15분간 반응시킨 다음 520 nm로 측정하여 다음과 같은 식을 이용해 catalse효소의 활성을 계산한다. 표준곡선은 과산화수소(H2O2)를 사용하였다.

5) 통계 분석

통계적 분석은 SPSS 12.0 for windows (SPSS Inc., USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였으며, 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 적용하였다. 각 군간 차이를 검증하기 위하여 t 검정(paired t-test)을 실시하고, 통계적 유의수준은 p<0.05로 실시하였다.

 

결 과

1. 피부주름의 육안적 관찰 소견

SKH-1 hairless 생쥐의 피부주름 양상을 육안적인 광노화 피부의 지표로 사용하기 위하여 silicone rubber로 replica 모형을 제작하여 실체현미경으로 관찰한 바 UVB를 4주간 조사하면서 vehicle을 도포하였다. Saline을 투여한 대조군(Fig. 1)에서는 잔주름과 깊게 패인 굵은 주름이 현저하게 관찰되었고 UVB를 4주간 조사하면서 추출조건에 따른 감잎 추출물을 4주간 투여하고 도포한 감잎 추출물 I군(PLT-I), -Ⅱ군(PLT-Ⅱ) 및 -Ⅲ군(PLT-Ⅲ)에서는 대조군에 비하여 잔주름과 굵은 주름이 미약하게 관찰되었다(Fig. 1).

Fig. 1.Photographs showing skin wrinkles of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ). The effects of PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ treated groups showing mild increased wrinkling and some loss of fine striation on back skin compared to control group(C). Especially PLT Ⅱ group showing more decreased wrinkling than those of PLT-I and -Ⅱ groups.

2. 피부의 일반적인 조직학적 변화 관찰

1) 피부의 표피세포의 증식 억제효과

SKH-1 hairless 생쥐의 피부조직을 H&E 염색하여 표피세포의 증식과 표피의 두께를 광노화 피부의 지표로 하여 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)의 등쪽피부의 표피는 3-4층 (표피두께 39.5±4.2 ㎛)의 상피세포로 이루어졌으나(Fig. 2-3) UVB를 4주간 조사한 대조군(C)의 표피는 7-8층(표피두께 81.3±12.8 ㎛)의 상피세포로 증식되었다(Fig. 2-3). UVB를 조사하면서 4주간 추출조건에 따른 감잎 추출물을 투여하고 도포한 PLT군들에서는 대조군에 비하여 상피세포의 층이 감소하여 PLT-I군에서는 표피두께가 60.1±8.4 ㎛의 상피세포층으로 이루어졌고(Fig. 2-3) 특히 PLT-Ⅱ군에서는 표피두께 52.2±7.4 ㎛의 상피세포층으로 현저히 감소하였다(Fig. 2-3). 또한 PLT-Ⅲ군에서는 표피두께 66.8±7.7 ㎛의 상피세포층으로 대조군에 비하여 감소하였다(Fig. 2-3). 진피층내 염증세포의 수는 대조군에 비하여 PLTs군이 대체로 감소하였으나 특히 PLT-Ⅱ군에서 현저하게 감소하였다.

Fig. 2.Histological changes in the dorsal skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ) and non-irradiated normal group(N)(H&E stain, ×200). The effects of PLTs treated groups showing decreased epithelial cell layers(epidermal thickness) and some loss of collagen fibers in dermis compared to control group(C). Especially PLT-Ⅱ group showing more decreased some loss of collagen fibers in dermis than those of PLT-I and -Ⅱ groups. Arrows, papillary layer of dermis; *, inflammatory cells.

Fig. 3.Changes of epidermal thickness in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ) and non-irradiated normal group(N). The effects of PLT treated groups showing decreased epithelial cell layers(epidermal thickness) compared to control group(C). Values are mean ± SD of 5 mice. #p<0.05 compared with normal group(N); *p<0.05 compared with control group(C).

2) 피부 진피층의 교원섬유 보호 효과

SKH-1 hairless 생쥐의 피부조직을 Van Giesson 염색을 시행하여 표피-진피결합부위 교원섬유(collagen fibers)의 염색정도를 광노화 피부의 지표로 하여 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군(Fig. 4)의 표피 밑의 진피층(특히 유두층)에서는 acid fuchsin에 강하게 염색된 교원섬유가 띠모양으로 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)(Fig. 4)에서는 변성된 교원섬유가 acid fuchsin에 미약하게 염색되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎 추출물을 투여한 PLT군에서 진피층의 유두층에서는 대조군에 비하여 acid fuchsin에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다(Fig. 4). 특히 PLT-I군과 PLT-Ⅱ군은 PLT-Ⅲ군에 비하여 acid fuchsin에 강하게 염색되었다.

Fig. 4.Histological changes in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ) and non-irradiated normal group(N)(Van Giesson stain, ×200). The effects of PLT treated groups showing increased staining intensity of collagen fibers within papillary layer of dermis compared to control group(C). Especially PLT-I and -Ⅱgroup showing more increased staining intensity of collagen fibers in dermis than those of PLT-Ⅲ groups. Arrows, acid fuchsin stained collagen fibers; Arrows, dermal papillary layer.

Masson’s trichrome염색을 시행하여 교원섬유를 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군(Fig. 5)에서는 표피 밑의 진피층(특히 유두층)에서는 aniline blue에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(Figure 5)에서는 변성된 교원섬유가 aniline blue에 미약하게 염색되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎 추출물을 투여한 PLT-I, -Ⅱ, -Ⅲ군의 진피의 유두층에서는 대조군에 비하여 aniline blue에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다(Fig. 5). 특히 PLT-I군과 PLT-Ⅱ군은 PLT-Ⅲ군에 비하여 aniline blue에 강하게 염색되었다.

Fig. 5.Histological changes in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ) and non-irradiated normal group(N)(Masson’s trichrome stain, ×200). The effects of PLT treated groups showing increased collagen fibers within papillary layer of dermis compared to control group(C). Especially PLT-I and Ⅱ group showing more increased staining intensity of collagen fibers in dermis than those of PLT-Ⅲ group. Arrows, methyl blue stained collagen fibers; Arrows, dermal papillary layer.

3. 피부 비만세포의 숫적변화 관찰

SKH-1 hairless mice의 등의 피부조직을 toluidine blue 염색을 시행하여 비만세포의 숫적변화를 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군(Fig. 6)의 등쪽 피부의 진피층내 비만세포는 21.7±5.2개가 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(Fig. 6)의 진피층내 비만세포는 37.3±2.4개로 정상군에 비하여 유의성있게 증가하였다. UVB를 조사하면서 4주간 추출조건을 달리하여 추출한 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, PLT-II 및 PLT-II군의 진피층내 비만세포는 각각 26.8±2.6개, 24.1±2.8, 20.2±2.0개가 관찰되어 대조군에 비하여 유의성있게 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 6).

Fig. 6.Numerical changes of mast cells in the dorsal skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-II, PLT-III) and non-irradiated normal group(N). The effects of PLT-I, -II and -III treated groups showing decreased toluidine blue stained mast cells within dermis compared to control group(C). Each values are mean ± SD of 5 mice. # p<0.05 compared with normal group(N); * p<0.05 and ** p<0.01 compared with control group(C).

4. 피부의 면역조직화학적인 변화 관찰

1) Mast cell tryptase에 대한 면역염색 반응

SKH-1 hairless mice의 피부조직내 진피층의 비만세포내 분비과립을 관찰하기 위하여 mast cell tryptase 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. Mast cell tryptase에 의하여 발현된 비만세포는 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig. 7)의 진피층에서는 소수의 세포들이 강하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)(Fig. 7)의 진피층에서는 N군에 비해 다수의 세포들이 관찰되었고 염색반응도 정상군에 비하여 미약하였다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군에서는 대조군보다는 숫적으로 감소하는 경향을 나타내었으며 면역염색 반응은 대조군보다 약간 강하게 발현되었다(Fig. 7).

Fig. 7.Immunohistological changes of mast cell tryptase in dorsal skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-II, PLT-III) and non-irradiated normal group(N)(mast cell tryptase immunohistochemical stain, x200). The effects of PLT-I, -II, -III treated groups( PLT-I, PLT-II, PLT-III) showing decreased immunoreacted mast cells within dermis compared to control group(C). Arrows, Immunoreacted mast cells; Arrows, mast cell tryptase immunoreacted cells.

2) Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)에 대한 면역염색반응

SKH-1 hairless mice의 피부조직의 표피 상피세포의 분열상태를 관찰하기 위하여 증식세포핵항원(PCNA)항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. PCNA의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig. 8)의 표피 상피세포층에서는 기저층 한 층에서만 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)(Fig. 8)의 표피 상피세포층에서는 N군에 비해 비교적 기저층 뿐만아니라 여러층에서 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군에서는 정상군과 유사하게 기저층 한층에서만 발현되었다(Fig. 8).

Fig. 8.Immunohistological changes of PCNA in skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-II, PLT-III) and non-irradiated normal group(N)(PCNA immunohistochemical stain, x200). The effects of PLT-I, -II, -III treated groups showing reduced PCNA expression within epidermis compared to control group(C); Arrows, PCNA immunoreacted cells.

3) Vascular endothelial growth factor(VEGF)에 대한 면역염색 반응

SKH-1 hairless mice의 피부조직의 광노화 피부와 관련된 혈관형성의 지표를 관찰하기 위하여 VEGF 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. VEGF의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig. 9)군의 표피의 상피층에서는 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)(Fig. 9)의 표피 상피세포층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차를 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig. 9).

Fig. 9.Immunohistological changes of VEGF in skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-II, PLT-III) and non-irradiated normal group(N)(VEGF immunohistochemical stain, x200). The effects of PLT-I, -II, -III treated groups showing reduced VEGF expression within epidermis compared to control group(C); Arrows, VEGF immunoreacted cells.

Fig. 10.Changes of SOD concentration in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ) and non-irradiated normal group(N). Data represent the mean ± SD of 3 independent measurements. #p<0.001, compared to normal (N); *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, compared to control (C).

4. 피부 유해산소 대사 효소 활성도 측정

조직내 유해산소 대사 효소 활성도를 측정하기 위해 조직을 마쇄한 후 superoxide dismutase(SOD)와 catalase(CAT) 측정을 시행한 결과, SOD는 정상군(N)과 대조군(C)에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 대조군에 비해 감잎 Ⅲ(PLT-Ⅲ)군에서 0.5 U/㎖가 증가하여 유의적으로 증가하였다(Fig. 10). Catalase는 정상군에 비해 대조군에서 활성이 50% 이상 감소하였으며 PLT-Ⅰ,-Ⅱ,-Ⅲ 군 모두 대조군 보다 증가하였으며 그중에서 특히 PLT-Ⅱ군에서는 정상군(N)보다 2배 이상 증가하였다(Fig. 11). 이런 결과는 각종 원인에 의해 생성된 유해산소를 과산화수소로 전환시키는데 관여하는 SOD는 PLT-Ⅲ군이 유의적으로 증가하였으며, 이렇게 전환된 과산화수소를 물로 다시 전환시켜 해독시켜주는 기능을 하는 catalase를 활성화시켜주는데 PLT-Ⅱ군이 가장 우수하였다는 것을 의미한다.

Fig. 11.Changes of Catalase activity in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, PLT-I, PLT-Ⅱ, PLT-Ⅲ) and non-irradiated normal grxoup(N). Data represent the mean ± SDs of 3 independent measurements. #p<0.001, compared to normal(N); *p<0.05, ***p<0.001, compared to control (C).

 

고 찰

피부의 노화는 온도, 습도, 매연 및 기계적인 자극과 같은 외부환경 인자에 항상 노출되기 때문에 다른 기관의 노화와는 차이가 있으며, 이들 인자 중 자외선이 피부에 가장 많은 영향을 미치고 있다25-27). 피부는 표피와 진피로 구성되며, 표피(epidermis)는 피부의 제일 바깥층으로서 상피로 구성되어 있으며, 표피 밑의 진피(dermis)는 표피를 기계적으로 지지하는 지지층으로서 결합조직과 다양한 종류의 세포로 구성되어 있어 피부에 장력과 탄력을 제공하고 있다28).

피부노화는 내재적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photoaging)로 나누며, 내재적인 노화는 모든 생물체에서 공통적으로 일어나는 생물학적인 기전에 의하여 발생하며2), 광노화는 태양광선에 장기간 노출될 때 발생한다29,30).

자외선은 파장의 종류에 따라 피부에 침투하는 부위에 차이가 있는데 UVB(280-320 nm)는 대체로 표피에서 흡수되므로 표피상피(각질세포)에 영향을 미치며, UVA(320-400 nm)는 보다 심층부위에 침투하므로 표피의 각질세포와 진피의 섬유아세포에 영향을 미친다31). 짧은 파장의 UVB는 홍반, 주름 및 피부암과 같은 광손상을 야기하고, UV에 의한 활성산소종을 생성하여 아교질, 탄성질, 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans)과 같은 세포외기질의 구조적 또는 기능적인 변화를 초래하며, 세포구성 성분인 DNA, 단백질 및 지질의 변성을 초래한다32).

피부의 노화는 아교질의 합성과 분해정도에 따라 주름이 생기고 탄력을 잃으며, 주로 진피층에 있는 기질 단백질인 아교질의 결핍에 의하여 발생한다. 피부가 자외선에 노출되면 진피층의 섬유아세포에서 아교질의 생산이 감소하고, 기질금속 단백질 분해 효소인 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가하여 기질 단백질의 분해가 증가된다는 것이 밝혀짐으로써, 자외선이 피부 노화의 주원인 중 하나임이 알려졌다33-36). 피부노화에 관한 연구는 자외선과 아교질과의 관계 및 MMPs의 조절에 대한 연구가 많이 진행되고 있으며36), 광노화 된 피부에서 탄력섬유의 비정상적인 침착 현상에 대한 연구가 중점적으로 이루어져 왔다37). 최근에는 피부노화 억제와 치료를 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 특히 피부에 부작용이 적은 천연소재에서 생리활성 물질을 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

감은 우리나라와 일본, 중국 등 동양권 이외에 서양에서도 그 효능이 많이 알려져 있으며, 감잎도 녹차 이상으로 다양한 생리활성물질을 함유하고 있다고 보고되고있다. 감잎은 감나무과의 갈잎 큰키나무 감나무(Diospyros kaki THUNB.)의 잎으로 柿葉이라 하며, 性은 寒하고 味는 苦하며 무독하며, 止血과 血小板감소성 紫斑을 치료하는 데 효능이 있으며, 잎에는 비타민 C, 카로틴 및 pantothenic acid가 풍부하고, 특히 잎에서 추출한 flavonoid glycoside는 혈압을 내리고 관상동맥의 혈류량을 증가시킨다고 하였다38,39). 감잎은 다른 과일에 비해 비타민 A와 C가 풍부하여 여러가지 생리활성을 나타내며, 기능성 페놀화합물이 다량 함유되어 있어 항산화기능, 노화방지, 심혈관계 질환 예방 및 항암효과 등이 보고되어 있다40-42). 감잎의 성분과 그 효과에 관한 연구는 최근에 많이 이루어지고 있는 실정이다. 감잎의 성분으로는 tannin, polyphenol류, 수지, coumarin류 화합물, betulic acid, oleanolic acid, ursolic acid와 같은 유기산 및 엽록소, astragalin, myricitrin과 같은 flavonoid 배당체, 비타민 A와 C를 과량 함유하고 있으며 비타민 B1, 판토텐산, 엽산의 함유량이 많은 것으로 보고되고 있다43).

감잎에 대한 연구는 감잎의 처리방법과 추출조건에 따른 Vitamin C와 superoxide dismutase(SOD) 유사활성의 변화44), 항산화 효과45), 돌연변이 억제 효과46), 간손상 억제 효과47) 및 알레르기성 접촉피부염48) 등에 대하여 보고되었다. 또한 An 등(2005)49)은 감입에서 추출한 폴리페놀이 유해산소(xanthine oxidase)의 생성을 억제하고, tyrosinase, elastase 및 collagenase를 억제한다고 하였다.

현재까지 감잎의 연구는 감잎 추출물의 항산화 효과와 알레르기와 관련된 연구는 많이 진행되어 있으나 감잎 추출물의 광노화피부와 관련된 연구는 미흡한 실정이다. 그러므로 본 연구에서는 감잎 추출물의 광노화피부 개선 효과를 관찰하기 위하여 hairless mice를 이용하여 자외선에 의한 광노화 피부 억제인자들의 변화를 형태학적으로 관찰하였다.

본 실험에서 UVB를 조사한 후 피부주름을 육안적으로 관찰한 바 SKH-1 hairless 생쥐에 silicone rubber로 replica 모형을 제작하여 실체현미경으로 관찰한 결과 UVB를 4주간 조사하면서 vehicle을 도포하고 saline을 투여한 대조군에서는 잔주름이 많이 관찰되고, 깊게 패인 굵은 주름이 현저하게 관찰되었다. 같은 조건에서 감잎 추출물을 투여하고 도포한 처리군에서는 대조군에 비하여, 특히 감잎(PLT)-Ⅱ군에서 잔주름과 굵은 주름이 약하게 관찰되었다. 추출조건에 따른 감잎 추출물 투여군 간에는 PLT-Ⅱ군에서 주름의 분포양상이 약하게 관찰되었으므로, 감잎 추출물은 주름형성과 관련된 여러 가지 인자들을 억제함으로써 피부노화에 의한 주름형성을 억제할 것으로 사료되었다.

진피는 아교섬유와 탄성섬유로 구성되었으며, 아교섬유는 진피의 주요 성분으로서 피부에 장력과 구조적인 통합을 이루게하고50), 탄성섬유는 일부 구성성분을 이루고 있지만 피부에 탄력을 준다. 피부노화는 조직학적으로 섬유아세포의 수적감소 및 아교질과 elastin의 양이 감소되면서 세포외기질이 위축되는 것을 말한다51-53). 본 실험에서 생쥐 피부조직을 H&E 염색하여 표피세포의 증식과 표피의 두께를 관찰한 결과, 정상군의 등피부의 표피는 두께가 약 39.5 ㎛(3-4층)의 상피세포로 이루어졌으나 UVB를 조사한 대조군의 표피두께는 약 81.3 ㎛(7-8층)로 상피세포가 증식하였다. 감잎(PLT) 처리군에서는 대조군에 비하여 상피세포의 층이 감소하여 감잎(PLT)-I군에서는 상피세포가 약 60.1 ㎛, 감잎(PLT)-Ⅱ군은 약 52.2 ㎛, 감잎(PLT)-Ⅲ군은 66.8 ㎛의 상피세포층으로 대조군에 비하여 감소하였다. 진피층내 염증세포의 수는 대조군에 비하여 감잎 처리군이 대체로 감소하였고 특히 감잎(PLT)-Ⅱ군이 많이 감소하였다.

UVB를 조사하면서 감잎 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I군과 PLT-Ⅱ군에서는 대조군에 비하여 상피세포의 비대와 진피층 내 염증세포의 수를 현저히 감소시킴으로써 감잎 추출물이 광노화 피부의 항염작용과 표피 상피세포의 증식을 억제할 것으로 사료되었다. 본 실험에서 SKH-1 hairless 생쥐의 피부조직을 Van Giesson 염색을 시행하여 표피-진피결합부위 교원섬유(collagen fibers)의 염색정도를 관찰한 결과, 정상군의 표피 밑의 진피층(특히 유두층)에서는 acid fuchsin에 강하게 염색된 교원섬유가 띠모양으로 관찰되었으나 대조군에서는 변성된 교원섬유가 acid fuchsin에 미약하게 염색되었다. UVB를 조사하면서 감잎 추출물을 투여, 도포한 처리군에서는 진피층의 유두층에서 대조군에 비하여 특히 감잎(PLT)-Ⅰ군과 PLT-Ⅱ군이 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다. 또한 Masson’s trichrome염색을 시행하여 교원섬유를 관찰한 결과 정상군에서는 표피 밑의 진피층(특히 유두층)에서는 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었으나 대조군에서는 변성된 교원섬유가 미약하게 염색되었다. 3종류의 감잎 처리군 중 특히 감잎(PLT)-I, PLT-Ⅱ군은 진피의 유두층에서는 대조군에 비하여 aniline blue에 강하게 염색되었다.

이상의 실험 결과는 UVB를 조사하면서 감잎 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I군과 PLT-Ⅱ군의 진피의 유두층에서는 대조군에 비하여 aniline blue와 acid fuschin에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었기에 감잎 I(PLT-I)과 Ⅱ(PLT-Ⅱ) 추출물은 표피-진피결합부위에서 교원섬유 단백질의 분해를 억제하여 주름생성을 억제할 것으로 사료되었다.

UVB(290-320nm) 자극 후 일어나는 부종 및 홍반과 같은 급성 염증은 피부의 비만세포에서 분비하는 히스타민이 중요한 매개 기능을 한다54). 사람의 피부에 자외선을 자극하면 비만세포 탈과립에 의하여 혈관주위에 부종과 홍반(erythema)이 나타난다55). 탈과립된 히스타민은 각질세포에 영향을 미칠 뿐만아니라 직접 UV가 조사된 부위56) 또는 인접한 림프절로 면역세포를 이동시켜 림프구 증식과 여러 가지 사이토카인의 방출을 조절한다57). 본 실험에서 SKH-1 hairless mice의 등의 피부조직을 toluidine blue 염색을 시행하여 비만세포의 숫적변화를 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군의 등쪽 피부의 진피층내 비만세포는 21.7±5.2개가 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군의 진피층내 비만세포는 37.3±2.4개로 정상군에 비하여 유의성있게 증가하였다. UVB를 조사하면서 4주간 추출조건을 달리하여 추출한 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, PLT-II 및 PLT-III군의 진피층내 비만세포는 각각 26.8±2.6개, 24.1±2.8, 20.2±2.0개가 관찰되어 대조군에 비하여 유의성있게 감소하는 경향을 나타내었다. 이상의 실험결과로 감잎차 추출물 투여 및 도포군에서는 비만세포 탈과립이 억제되어 면역염색 반응이 강하게 관찰되었으므로 감잎차 추출물은 비만세포 탈과립을 억제하는 기능이 있을 것으로 사료되었다.

피부에서의 혈관형성(angiogenesis)은 여러 가지 생리적 및 병리적인 상황에서 일어나며, 혈관내피세포성장인자(VEGF)의 피부내 적정 농도는 피부의 균형된 혈관형성을 유지하는데 중요한 지표물질로서 VEGF의 발현은 자외선에 노출된 피부에서 증가하고 있다58). Yano 등59)은 피부에서의 혈관형성은 광노화를 일으키는 중요한 기능을 하며, 혈관형성을 억제하여 자외선에 의한 피부 주름형성을 감소시킬 수 있다고 하였다. 본 실험에서 SKH-1 hairless mice의 피부조직내 표피 상피세포의 분열상태를 관찰하기 위하여 증식세포핵항원(PCNA)항체와 피부조직의 광노화 피부와 관련된 혈관형성의 지표를 관찰하기 위하여 VEGF 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행한바 PCNA는 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)의 표피 상피세포층에서는 N군에 비해 비교적 기저층 뿐만아니라 여러층에서 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군에서는 정상군과 유사하게 기저층 한층에서만 발현되었다. VEGF는 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)의 표피 상피세포층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차를 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다. 피부에서의 혈관형성은 광노화를 일으키는 중요한 기능을 하므로 본 실험의 감잎차 추출물 투여군에서 VEGF에 대한 면역반응이 약하게 나타난 것은 감잎차 추출물에 의한 혈관형성을 억제함으로써 자외선에 의한 주름형성을 감소시킬 것으로 사료되었다.

활성산소종은 고에너지 복사선, 광증감반응 및 일부 효소반응과 같은 과정을 거쳐 세포와 조직에서 생성되며, 생체 내에서 과잉의 활성산소는 염증, 돌연변이, 세포살해, 발암, 피부노화 등을 유발한다. 많은 양의 자외선에 노출되면 피부에는 높은 농도의 활성산소종이 생성된다. 계속된 활성산소의 공격은 피부의 항산화 방어 시스템을 파괴시켜 DNA, RNA, 효소 및 세포막에 손상을 일으켜 세포를 사멸시키거나 유전자 발현양식의 변화에 의한 피부암, 광독성 및 광노화를 유발한다60). 자외선에 의하여 생성된 H2O2와 hydroxy radical과 같은 free radical은 피부노화, 피부암, 염증, 허혈 등의 원인이 되며61), 이러한 산소 자유기는 전사인자인 NF(nuclear factor)-kB, AP(activator protein)-1의 binding activity를 증가시켜 기질 단백질인 아교질과 elastin 등을 분해하는 MMPs의 발현을 증가시켜 피부 기질 단백질 손상에 의한 피부주름을 유발한다고 알려졌다62-64). 본 실험에서 UVB를 조사한 생쥐의 피부 조직내 유해산소 대사 효소 활성도를 측정한 결과, 유해산소를 과산화수소로 전환시키는 SOD활성은 UVB를 조사한 대조군과 정상군과는 유의성이 보이지 않았으나 감잎(PLT)-Ⅲ군에서 0.5 U/㎖가 증가하여 유의적으로 증가하였고 과산화수소를 물로 다시 전환시켜 해독시켜 주는 CAT는 대조군에서 정상군의 50%이하로 감소하였으나 3종류의 감잎 처리군에서는 대조군보다 유의적으로 증가하였으며 특히 감잎(PLT)-Ⅱ가 정상군보다 2배 이상 증가하였다.

이상의 실험 결과로 감잎 추출물은 UVB에 의한 광노화 피부의 개선에 효과가 있을 것으로 사료되었고, 1차(PLT-I)와 2차(PLT-II) 감잎 추출물이 더욱 효과적인 것으로 사료되었다.

 

결 론

SKH-1 hairless 생쥐 모델을 이용하여 UVB 조사 후 감잎 열수추출물을 경구투여하고 도포한 후 광노화피부의 광학, 면역조직학적 변화 및 항산화에 대한 효과에 대한 결과를 요약하면 다음과 같다. 피부주름의 육안적인 변화는 대조군에서는 잔주름이 많이 관찰되었고, 깊게 패인 굵은 주름이 현저하게 관찰되었으나 감잎(PLT) 시료 처리군 모두 대조군에 비해 주름이 약하게 관찰되었으며 특히 감잎(PLT)-Ⅱ군이 우수하였다. 피부조직의 두께는 정상군에 비하여 대조군의 표피두께는 상피세포가 증식하였으나 감잎(PLT)-Ⅱ군 처리군에서는 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 교원섬유의 변화는 대조군에서는 변성된 교원섬유가 미약하게 염색되었으나 감잎(PLT)-I, PLT-Ⅱ처리군에서는 대조군에 비하여 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다. 피부조직내 비만세포는 UVB를 4주간 조사한 대조군의 진피층내 비만세포가 정상군에 비하여 유의성있게 증가하였다. UVB를 조사하면서 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, PLT-II 및 PLT-III군의 진피층내 비만세포는 대조군에 비하여 유의성있게 감소하는 경향을 나타내었다. 피부조직내 증식세포핵항원(PCNA)과 혈관내피세포성장인자(VEGF)에 대한 면역조직화학염색 반응은 PCNA와 VEGF는 UVB를 조사하면서 4주간 감잎차추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군에서는 정상군과 유사하게 기저층 한층에서만 미약하게 발현되었다. 피부조직내 유해산소 대사 효소 활성도 중에서 유해산소의 전환 및 해독하는 과정에 관여하는 SOD는 감잎(PLT)-Ⅲ군이 유의성있게 증가하였으며, CAT활성은 감잎(PLT)-I, -II 및 –III군이 유의성 있게 증가하였다.

이상의 실험결과로 3종류의 감잎 추출물 중 PLT-Ⅰ군과 PLT-Ⅱ군이 UVB조사에 의한 피부노화에 대한 개선효과가 우수한 것으로 입증되었으므로 향후 감잎의 생체 내 이용에 대한 다양한 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 사료되었다.