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Attenuation of Particulate Matter 2.5-induced Oxidative Damage by Baicalein is Associated with Activation of the Nrf2/HO-1 Axis in Human Keratinocytes

인간 각질형성세포에서 Nrf2/HO-1 신호 전달의 활성화에 의한 baicalein의 미세먼지 유도 산화적 손상의 억제

  • Da Hye Kwon (Department of Food and Nutrition, College of Nursing, Healthcare Sciences & Human Ecology, Dong-eui University) ;
  • Hye-Jin Hwang (Department of Food and Nutrition, College of Nursing, Healthcare Sciences & Human Ecology, Dong-eui University) ;
  • Yung Hyun Choi (Anti-Aging Research Center, Dong-eui University)
  • 권다혜 (동의대학교 식품영양학과) ;
  • 황혜진 (동의대학교 식품영양학과) ;
  • 최영현 (동의대학교 항노화연구소)
  • Received : 2025.06.23
  • Accepted : 2025.07.14
  • Published : 2025.09.30
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Abstract

Among air pollutants, particulate matter (PM) is known to induce oxidative stress in skin cells, leading to severe damage such as inflammation, premature aging, and apoptosis. Baicalein, a flavonoid compound derived from the roots of Scutellaria baicalensis, exhibits potent antioxidant activity. However, its protective effects against PM-induced skin cell damage have not yet been elucidated. In this study, we investigated whether baicalein could protect HaCaT human keratinocytes from damage caused by PM2.5. Our findings demonstrate that baicalein significantly prevented the PM2.5-induced reduction in cell viability, although it did not affect the cellular uptake of PM2.5. Baicalein also inhibited apoptosis by suppressing PM2.5-induced intracellular reactive oxygen species (ROS) levels. Furthermore, baicalein enhanced the phosphorylation and nuclear translocation of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), particularly in the presence of PM2.5, and subsequently upregulated both the expression and enzymatic activity of heme oxygenase-1 (HO-1). Notably, the protective effects of baicalein against PM2.5-induced ROS generation and cytotoxicity were diminished in the presence of zinc protoporphyrin, an HO-1 inhibitor. Our results suggest that baicalein acts as a potent Nrf2 activator and represents a promising natural agent for the prevention and treatment of PM2.5-induced oxidative stress-related skin injury.

대기 오염 물질 중 미세먼지(PM)는 피부 세포에 산화 스트레스를 유발하여 염증, 노화, 세포 사멸 등을 포함한 심각한 손상을 유발할 수 있다. 황금(Scutellaria baicalensis)의 뿌리에서 추출되는 flavonoid 화합물의 일종인 baicalein은 강력한 항산화 활성이 있는 것으로 알려져 있지만, PM에 의해 유도되는 피부 세포의 손상에 미치는 영향은 보고된 바 없다. 본 연구에서는 HaCaT 인간 각질형성세포에서 PM2.5에 의하여 유발되는 세포 손상을 baicalein이 보호할 수 있는지를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, baicalein은 PM2.5에 처리에 의한 세포 생존율의 저하를 유의적으로 억제하였으나 세포 내 PM2.5의 내재화에는 큰 영향을 미치지 못하였다. Baicalein은 또한 PM2.5 처리에 의한 PARP의 단편화를 차단하면서 세포 사멸을 억제하였으며, 이는 ROS 생성 감소와 연관성이 있었다. 아울러 baicalein은 Nrf2의 인산화와 인산화된 Nrf2의 핵 내 전이를 증가시켰으며, 이는 PM2.5가 존재하는 조건에서 더욱 촉진되었고 HO-1의 발현과 활성을 모두 향상시켰다. 그러나 HO-1 저해제인 ZnPP가 존재하는 조건에서는 PM2.5에 의한 ROS 생성과 세포 독성 차단에 대한 baicalein의 억제력은 감소되었다. 이러한 결과는 baicalein이 Nrf2의 활성제로서 PM2.5에 의해 유발되는 산화 스트레스 매개 피부 손상에 대해 치료 및 예방 잠재력이 유망한 천연물임을 의미한다.

Keywords

1. 서론

공기 중 미세 입자들이 복잡하게 섞인 미세먼지(particulate matter, PM)는 대기 오염의 주요 원인으로, 일반적으로 크기에 따라 10 micrometer 미만인 PM10과 2.5 micrometer 미만인 PM2.5로 분류된다[34]. 단기간 노출은 호흡기 자극을 유발하고 기존 심장 및 폐질환을 악화시킬 수 있으며, 장기간 노출은 폐 기능 저하, 만성 기관지염, 심지어 조기 사망과 같은 더 심각한 문제로 이어질 수 있다[23, 35]. 특히 크기가 작을수록 인체 깊숙이 침투하여 다양한 질환의 개시와 진행에 관여하여 인체 건강에 심각한 영향을 미칠 수 있는데, PM10에 비하여 PM2.5는 호흡기 손상, 심혈관 질환, 만성 신장 질환, 지적 발달 장애, 알츠하이머병, 암을 포함한 다양한 질병의 위험 증가와 크게 관련이 있는 것으로 나타났다[3, 7, 10, 12, 14, 22, 34, 37].

다양한 기관 중, 외부 환경에 직접 노출되는 피부는 PM과 같은 환경 오염 물질에 취약하다. PM은 피부 장벽 기능을 저해하고 염증을 유발하며, 노화 촉진을 유발할 수 있고 기존 피부 질환을 악화시킬 수 있으며, 심지어 피부암 발병에도 영향을 미친다[1, 28]. 아울러 PM은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성을 촉진하여 피부의 항산화 방어 기능을 저해하고 산화 스트레스를 유발하며 염증 반응을 증가시킨다[12, 16, 29]. 그동안 여러 연구에서 피부 건강에 대한 PM2.5의 유해한 영향에도 산화 스트레스 유발과 매우 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있다. 예를 들어 인간 각질형성세포(keratinocytes)와 마우스 피부에서 PM2.5에 의한 DNA 손상, 지질 과산화, 그리고 단백질 carbonylation은 ROS 생성에 따른 것이었다[12, 30, 31]. 이로 인하여 소포체 스트레스(endoplasmic reticulum stress), 미토콘드리아 부종(mitochondrial swelling), 그리고 자가포식(autophagy)과 함께 세포사멸(apoptosis)이 유도되었지만, 항산화제인 N-acetyl cysteine (NAC)에 의해 억제되었으며, 이는 PM2.5 세포 독성이 산화 스트레스에 기인하였음을 의미한다[21, 24, 30]. 따라서 과도한 ROS 생성의 억제는 PM에 의한 피부 손상은 완화시킬 수 있을 것이며, 항산화 활성이 우수한 천연물을 이용하여 PM2.5에 의한 피부 세포 손상을 차단하고자 하는 연구가 광범위하게 이루어지고 있다.

Baicalein은 황금(黃芩, Scutellaria baicalensis)의 뿌리에서 추출되는 flavonoid 화합물의 일종으로, 항산화 활성을 포함한 다양한 생리 활성 효과를 가지는 것으로 알려져 있다[5, 25]. 예를 들어, baicalein은 ROS 생성을 차단하여 ultraviolet B(UVB) 또는 과산화 수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 같은 산화 자극에 의한 각질형성세포 손상을 억제하였음이 보고된 바 있다[20, 26]. 그리고, UVB에 노출된 인간 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)에서도 baicalein의 ROS 생성 억제를 통한 세포사멸을 차단하였으며, 이는 산화 스트레스, 염증 및 세포 항상성에 핵심적으로 관여하는 전사인자인 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)의 활성 증가와 연관성이 있었다[13]. Baicalein이 Nrf2의 활성화를 유도하여 ROS 생성을 감소시켰음은 Tanaka 등[33]에 의해서 주요 환경오염 물질인 benzo[a]pyrene이 처리된 각질형성세포에서도 확인되었다. 그리고 baicalein은 H2O2 처리에 의한 각질형성세포의 ROS 생성을 억제하면서 미토콘드리아 항상성과 세포 밀착 연접을 유지하였는데, 이 또한 Nrf2 경로를 통한 Nrf2 하위 항산화 효소인 heme oxygenase-1 (HO-1)과 NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 (NQO-1)의 상향 조절에 의한 것이었다[19]. 이러한 결과들은 baicalein이 Nrf2 활성제로서 다양한 산화 자극에 의한피부 세포를 보호할 수 있음을 보여 준다. 그럼에도 불구하고 PM에 의한 피부 손상을 baicalein이 억제할 수 있는지에 관한 연구는 이루어진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 인간 각질형성세포에서 PM2.5에 의한 산화적 세포 손상을 baicalein이 개선할 수 있는지, 그리고 이 과정에서 Nrf2가 관여하는지를 조사하였다.

2. 재료 및 방법

2.1 세포 배양과 PM2.5 및 baicalein의 처리

본 연구 사용된 HaCaT 인간 각질형성세포는 American Type Culture Collection (CRL-1458TM, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 선행 방법에 준하여 배양하였으며[24], 세포 배양에 사용된 재료들은 WELGENE (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다. PM2.5는 National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입한 표준품(SRM 1650b standard diesel PM2.5)을 사용하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 용해하여 원액을 제조하였다. 부유된 PM2.5 입자의 응집을 방지하기 위해 용액을 수조에서 30분간 초음파 처리하였다. Sigma-Aldrich Chemical Co.에서 구입한 baicalein도 DMSO에 녹여 원액을 제조하였으며, 세포 배양 배지에 적정 농도로 희석하여 처리하였다.

2.2 세포 생존율 분석

Baicalein과 PM2.5 단독 또는 동시 처리에 따른 HaCaT 세포의 세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 통하여 조사하였다. 이를 위하여 다양한 농도의 baicalein 또는 PM2.5를 24시간 처리하거나 적정 농도의 baicalein을 1시간 전처리 후 PM2.5 또는 HO-1 억제제인 zinc protoporphyrin (ZnPP, Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 처리하여 24시간 배양하였다. 처리 후, MTT 용액(1 mg/ml, Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 첨가하고 4시간 동안 반응시킨 후 생성된 formazan 결정을 DMSO에 용해했다. 이어서 microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군과 비교하여 세포 생존율을 계산하였다. 아울러 다양한 조건에서 배양된 세포의 형태는 광학 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 관찰하였다.

2.3 ROS 생성 분석

PM2.5 처리에 의한 ROS의 생성에 미치는 baicalein 또는 ZnPP의 영향을 조사하기 위하여 2ʹ,7ʹ-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA)를 사용하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포에 PM2.5 또는 ZnPP를 30분 동안 처리하기 전에 baicalein을 1시간 처리하였으며, phosphate-buffered saline (PBS)으로 세척하고 5 μM의 DCF-DA로 30분간 염색 후 4ʹ,6-diamidino-2-phenyl-indole (DAPI, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 용액으로 핵을 염색하였다. 이어서 형광 현미경(Carl Zeiss) 하에서 ROS 생성 정도를 관찰하거나 유세포 분석기(MuseTM Cell Analyzer, Millipore Corporation, Hayward, CA, USA)를 이용하여 ROS 생성 수준을 정량적으로 평가하였다.

2.4 세포사멸 분석

PM2.5 처리에 의한 HaCaT 세포의 세포 사멸 유도에 미치는 baicalein의 영향을 조사하기 위하여 세포에 baicalein 또는 PM2.5를 24시간 처리하거나 적정 농도의 baicalein을 1시간 전처리 후 PM2.5를 처리하여 24시간 배양하였다. 이어서 Annexin V/Propidium Iodide (PI) apoptosis detection kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용한 세포 사멸의 정량화를 위하여 kit에서 제공된 결합 완충액에 세포를 현탁한 후 annexin V-FITC와 PI 완충액을 첨가하고 제조사의 프로토콜에 따라 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포를 유세포 분석기를 이용하여 annexin V-양성 세포를 세포사멸이 유도된 세포의 빈도로 산출하였다.

2.5 단백질 발현 분석

Baicalein이 있거나 없는 조건에서 PM2.5가 처리된 HaCaT 세포 내 다양한 단백질 발현 변화를 조사하기 위하여 Western blotting을 수행하였다. 이를 위하여 처리가 끝난 세포를 PBS로 세척하고 RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 총 단백질을 추출하였으며, NE-PERTM nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo Fisher Scientific)로 세포질 및 핵의 단백질을 분리하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용한 전기영동으로 분리하고 Immun-Blot® PVDF membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 전이시켰다. 비특이적 상호작용을 줄이기 위해 5% non-fat dry milk로 실온에서 블로킹한 후, membrane을 검출 대상 단백질 항체와 반응시키고 세척하였다. 이어서 horseradish peroxidase가 접합된 2차 항체와 반응시킨 후, Enhanced Chemiluminescence 기질(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하여 단백질의 발현 정도를 관찰하였다. 본 연구에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA), Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 및 Abcam Inc. (Cambridge, UK)에서 구입하였다.

2.6 면역 형광 분석

HaCaT 세포 내 인산화된 Nrf2 (p-Nrf2)의 발현을 분석하기 위해서는 세포를 poly-L-lysine (Sigma-Aldrich Chemical Co.)이 코팅된 커버 슬립 위에 안정화되도록 24시간 배양하였다. 이어서 100 μM의 baicalein을 1시간 처리 후 100 μg/ml의 PM2.5를 24시간 처리한 다음, PBS로 세척하고 4% paraformaldehyde (Thermo Fisher Scientific)로 고정하였다. 고정된 세포에 0.01% Triton X-100 용액(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 처리한 후, PBS에 녹인 1% bovine serum albumin(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 이용하여 차단하였다. 이어서 세포를 p-Nrf2 항체(Ser40, Thermo Fisher Scientific)로 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후, 세포를 이차 항체(fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated secondary antibody, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 처리하였다. 추가로 핵을 염색하기 위하여 DAPI 용액을 이용하여 10분간 염색한 후, 세척하고 형광 현미경을 이용하여 p-Nrf2의 이미지를 관찰하였다.

2.7 HO-1 활성 분석

HO-1의 효소 활성은 HO-1 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Abcam Inc.)를 사용하여 측정하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포에 baicalein을 1시간 동안 전처리한 후, PM2.5 또는 ZnPP를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서 제조사에서 제시한 조건에서 세포를 채취하여 반응시킨 후, 464 nm와 530 nm에서 흡광도 차이를 측정하여 추출된 bilirubin의 양을 측정하였다. HO-1 활성은 시간당 단백질 milligram 당 생성된 bilirubin의 picomole로 제시하였다.

2.8 통계 분석

통계 처리가 필요한 실험은 모두 세 번 이상 독립적으로 수행하였으며, GraphPad Prism software (version 8.0, Graph Pad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 실시하였다. 실험 결과는 평균 ± 표준편차(standard deviation, SD)로 표현하였으며, 통계적 유의성은 p 값이 0.05 미만인 경우로 설정하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1 PM2.5에 의한 세포 독성에 미치는 baicalein의 영향

HaCaT 세포에서 baicalein이 PM2.5에 의한 세포 독성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 먼저 다양한 농도의 baicalein과 PM2.5가 24시간 처리된 세포의 세포 생존율을 MTT 분석법으로 조사하였다. Fig. 1A의 결과에 나타내었듯이, 24시간 동안 100 μM 이하의 baicalein에 노출된 세포에서는 유의적인 세포 생존율 감소가 관찰되지 않았지만, 200 μM과 300 μM의 baicalein 처리에 의해서는 대조군 대비 각각 85% 및 70% 정도의 세포 생존율을 보였다. 그리고 25 μg/ml 이하의 PM2.5가 처리된 세포에서는 세포 생존율이 대조군 수준으로 유지되었지만, 50 μg/ml 이상의 PM2.5가 처리된 세포의 세포 생존율은 PM2.5 처리 농도 증가에 따라 유의적으로 억제되었다(Fig. 1B). 이 결과를 바탕으로 PM2.5에 의한 세포 독성 유발 농도는 약 71%의 생존율을 보인 100 μg/ml로, baicalein 전처리를 위해서는 세포 독성이 관찰되지 않았던 100 μM 이하로 설정하였다. Fig. 1C는 100 μg/ml 이하의 baicalein을 1시간 처리 후, 100 μg/ml의 PM2.5를 24시간 처리한 세포들에 MTT 분석 결과이다. 제시된 결과에서 알 수 있듯이, 25 μg/ml의 baicalein이 전처리된 조건에서는 PM2.5에 의한 세포 생존율 감소가 억제되지 못한 반면, 50 μM 및 100 μM의 baicalein이 존재하는 조건에서 PM2.5가 처리된 세포에서는 대조군 대비 각각 76% 및 83% 정도의 생존율을 보여 주었다. 따라서 세포 독성이 없는 적정 농도의 baicalein 전처리는 PM2.5에 의한 세포 독성을 유의적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

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Fig. 1. Effect of baicalein on the reduction of HaCaT keratinocyte viability after PM2.5 treatment. Cells were subjected to varying concentrations of baicalein and PM2.5 for 24 hr (A and B) or treated with the indicated concentrations of baicalein for 1 hr before exposure to 100 μg/ml PM2.5 for 24 hr (C and D). (A‒C) Cell viability was assessed using the MTT assay. **p<0.01 and ***p<0.001 vs. control; #p<0.05 and ###p<0.001 vs. PM2.5-treated cells. (D) Representative images depicting morphological cellular changes are displayed.

몇몇 선행 연구에 의하면 다수의 천연물이 PM 유입을 완전히 차단할 수는 없지만, 항산화제 및 항염증제 역할로서 PM에 의한 세포 손상을 완화할 수 있었다[8, 15]. 따라서 baicalein에 의한 PM2.5 유도 세포 독성의 완화 효과가 세포 내 PM2.5 유입의 차단에 의한 것인지를 조사하기 위해 다양한 조건에서 배양된 세포의 형태를 관찰하였다. Fig. 1D의 결과에서 알 수 있듯이, PM2.5가 단독 처리된 세포에서는 세포 전체에서 PM2.5의 축적이 관찰되면서, 세포가 평평해지면서 부착력을 상실하는 듯한 형태를 보여 주었다. 그리고 baicalein이 전처리된 조건에서도 이와 유사한 형태를 보여 주어 baicalein이 세포 내로 PM2.5 유입의 효율적인 차단과 형태 변화의 완전한 회복에는 기여하지는 못하였음을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고 baicalein은 PM2.5에 의한 세포 독성을 억제하였기 때문에, 이는 PM2.5에 의한 세포 내 다양한 신호 전달계의 변화를 baicalein이 감소시켰기 때문이라고 추측된다.

3.2 PM2.5에 의한 ROS 생성 및 세포사멸 유도에 미치는 baicalein의 영향

각질형성세포에서 PM2.5에 의한 세포 독성의 유발은 ROS 생성에 의한 산화 스트레스와 매우 밀접한 연관성이 있다[18, 28, 30, 31]. 체내 세포 대사 산물로서 ROS는 상처 치유 및 회복을 촉진하고 대식세포의 면역력을 강화하는 기능을 하지만, 높은 수준의 ROS는 세포의 항산화 방어 기전을 무력화시켜 산화 스트레스와 DNA 손상을 유발하고 궁극적으로 세포사멸로 이어질 수 있다[2]. 따라서 HaCaT 세포에서 baicalein에 의한 PM2.5 유도 세포 독성의 억제가 ROS 생성 차단에 의한 것인지를 조사하기 위하여 baicalein이 있거나 없는 조건에서 PM2.5를 처리한 세포를 대상으로 DCF-DA 염색을 수행하였다. Fig. 2A 및 B의 유세포 분석 결과에서 알 수 있듯이, 100 μg/ml의 PM2.5가 단독 처리된 세포에서 ROS의 수준에 대조군 대비 약 9배 이상 증가하였다. 그러나 baicalein이 전처리된 세포에서는 처리 농도 의존적으로 ROS의 생성이 억제되었으며, 형광 현미경 하에서의 PM2.5가 단독 처리된 세포에서 ROS 생성을 의미하는 녹색 강도가 매우 강하게 검출되었지만, baicalein의 존재 하에서는 매우 약하게 줄어들었다(Fig. 2C). 따라서 이 결과는 baicalein이 PM2.5에 의한 산화 스트레스를 차단할 수 있음을 의미한다.

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Fig. 2. Inhibitory effect of baicalein on PM2.5-triggered ROS generation and apoptosis in HaCaT keratinocytes. Cells were treated with different concentrations of baicalein for 1 hr before exposure to 100 μg/ml PM2.5 for 1 hr (A‒C) or 24 hr (D‒F). (A and B) Cells were collected, stained with DCF-DA, and subjected to flow cytometry. Representative histograms (A) and quantitative change results (B) are presented. ***p<0.001 vs. control; ###p<0.001 vs. PM2.5-treated cells. (C) After treatment, cells were stained with DCF-DA (green), and nuclei were counterstained with DAPI (blue). Fluorescence images were observed under a fluorescence microscope. (D and E) Apoptosis was analyzed by annexin V/PI staining. Representative histograms (D) and mean values of annexin V-positive cells (E) according to flow cytometry are shown. ***p<0.001 vs. control; ###p<0.001 vs. PM2.5-treated cells. (F) After extracting the cell lysate, the expression change of PARP was investigated using Western blot analysis. β-actin was used as a loading control.

각질형성세포에서 PM2.5에 의한 산화 스트레스는 세포사멸의 원인으로 인식되고 있다. 예를 들어 Hu 등[12]의 결과에 의하면, PM2.5 노출은 HaCaT 세포에서 ROS 수치와 지질 산화의 산물인 malondialdehyde 생성을 증가시킨 반면, 항산화 효소인 superoxide dismutase 활성을 감소시키면서 DNA 손상 및 미토콘드리아 매개 경로를 통한 세포사멸을 유도하였다[28, 29]. 그러나 PM2.5에 의한 세포사멸은 NAC와 같은 항산화제뿐만 아니라 항산화 활성이 뛰어난 다양한 천연물에 의해서 ROS 생성을 차단하면서 효과적으로 억제되었다[9, 11, 24, 30, 38]. 따라서 PM2.5가 처리된 HaCaT 세포에서 baicalein에 의한 ROS 생성 차단이 세포사멸 억제와 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 다양한 조건에서 배양된 세포를 대상으로 Annexin V-FITC/PI 염색에 따른 유세포 분석을 실시하였으며, 100 μg/ml의 PM2.5가 단독 처리된 세포에서 세포사멸이 유도되었음을 의미하는 annexin V 양성 세포의 빈도가 대조군에 비하여 약 4.2배 증가하였다(Fig. 2D 및 E). 그러나 50 μM의 baicalein이 전처리된 세포에서는 대조군 대비 약 2배 정도 증가한 반면, 100 μM의 baicalein이 존재하는 조건에서는 대조군 수준으로 유지되어 PM2.5에 의한 세포사멸이 거의 완벽하게 차단되었음을 알 수 있었다. 한편, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)는 DNA 복구에 관여하는 단백질로서 전형적인 세포사멸이 유도되었을 경우, 활성화된 caspase에 의하여 절단되기 때문에 단편화된 PARP (cleaved PARP, c-PARP)는 세포사멸 유도의 바이오 마커로써 활용된다[27]. Fig. 2F에 나타내었듯이 PM2.5가 단독 처리된 세포에서 c-PARP의 발현이 검출되었지만, 이는 baicalein 전처리 농도 의존적으로 감소하였다. 이 결과는 baicalein이 ROS 소거제로서 PM2.5 유도 세포사멸의 억제에 기여하였음을 시사한다.

3.3 Baicalein에 의한 PM2.5 유도 세포 독성 차단에 미치는 Nrf2/HO-1 신호계의 역할

Nrf2는 산화 스트레스 하에서 세포의 보호를 위해 항산화 유전자의 발현을 촉진하여 세포 내 산화 방어 시스템을 강화한다[32]. 정상적인 조건에서 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)은 Nrf2와 결합하여 ubiquitin 의존적 분해를 유도하여 Nrf2의 활성을 낮게 유지한다. 그러나 산화 및 친전자성 스트레스나 독성 물질에 반응하여 Keap1의 ubiquitin ligase 활성이 억제되거나 분해되면 Nrf2는 Keap1에서 방출되어 인산화된다. 인산화된 Nrf2 (p-Nrf2)는 핵으로 이동하여 항산화 반응 요소(antioxidant response element)에 결합하여 항산화 및 해독 과정에 관여하는 표적 유전자의 발현을 활성화한다[6]. 각질형성세포에서도 baicalein은 다양한 산화 스트레스 하에서 Nrf2 경로를 활성화하여 강력한 항산화 효과를 발휘함이 밝혀졌다[19, 33, 36]. 아울러 항산화 활성을 갖는 다양한 천연물 또는 항산화제에 의한 PM2.5 유도 세포 독성 억제에도 Nrf2의 활성이 밀접한 연관성이 있었다[4, 17, 39]. 따라서 HaCaT 세포에서 PM2.5 유도 산화 스트레스에 대한 baicalein의 억제 효능에 Nrf2 신호 전달계가 관여하는지를 조사하였다. 이를 위하여, 세포에서 분리된 전체 단백질을 이용한 Western blotting 분석 결과에 의하면, 대조군 및 PM2.5 단독 처리군에 비하여 baicalein이 처리된 세포에서 Nrf2와 p-Nrf2, 그리고 Nrf2의 대표적인 하위 인자인 HO-1의 발현이 다소 증가하였다(Fig. 3A). 그러나 PM2.5와 baicalein이 병용 처리된 세포에서는 이들의 발현이 크게 증가되었고, Keap1의 발현은 baicalein 단독 처리군에서는 큰 변화가 없었으나, PM2.5가 함께 처리된 세포에서는 다소 감소하면서, 세포질 분획에 비하여 핵 분획에서 p-Nrf2의 발현이 상대적으로 높게 관찰되었다(Fig. 3B). 또한 p-Nrf2 항체를 이용한 면역 형광 분석에서도 p-Nrf2의 발현이 세포질 및 핵 내에서 baicalein 단독 처리에 비하여 강하게 관찰되었다(Fig. 3C). 그리고, 비록 PM2.5 단독 처리된 세포에서도 HO-1의 활성이 다소 증가하였지만, 유의적이지 않았으며 baicalein 처리에 의해서는 대조군에 비하여 약 2.3배 증가하였고, PM2.5와 baicalein이 동시 처리된 세포에서는 4.5배 정도 증가하였다(Fig. 3D). 그러나 HO-1의 효소 억제제인 ZnPP에 의해 증가한 HO-1의 활성은 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는 baicalein이 Nrf2 활성제로서 PM2.5가 존재하는 조건에서 Nrf2/HO-1 신호전달경로를 더 강화하였음을 의미한다.

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Fig. 3. Activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway by baicalein in PM2.5-treated HaCaT keratinocytes. Cells were pretreated with or without 100 μM baicalein or 10 μM ZnPP alone or together for 1 hr and then stimulated with 100 μg/ml PM2.5 for 24 hr. (A) Western blot images of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1 using whole cell lysates are shown. (B) After separating the nuclear and cytoplasmic fractions, p-Nrf2 expression was analyzed in each fraction. Lamin B and β-actin were used as loading controls for the nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. (C) After treatment, cells were reacted with p-Nrf2 antibody (red), and nuclei were counterstained with DAPI (blue). Representative fluorescence images are presented. (D) The enzyme activity of HO-1 was measured using an ELISA assay kit. ***p<0.001 vs. control; ###p<0.001 vs. PM2.5-treated cells; $$$p<0.001 vs. PM2.5 and baicalein-treated cells.

이어서 baicalein에 의하여 활성화된 Nrf2/HO-1 신호계가 PM2.5에 의한 ROS 생성과 세포 독성 유발에 직접 관여하는지 조사하였다. Fig. 4A 및 B에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 ZnPP를 이용하여 HO-1 효소 활성을 인위적으로 억제하였을 경우, HaCaT 세포에서 PM2.5에 의해 증가된 ROS 생성에 대한 baicalein의 억제 효과가 유의적으로 감소하였다. 또한 PM2.5에 의해 세포 생존율 저하에 대한 baicalein의 보호 효과도 상쇄되었으며(Fig. 4C), 이는 ROS의 축적이 PM2.5에 의한 세포 독성 유발에 핵심적으로 작용함을 의미한다. 아울러 이러한 결과는 PM2.5의 존재 하에서 baicalein에 의한 Nrf2 매개 HO-1의 활성화가 baicalein의 항산화 활성에 핵심적으로 관여하였음을 시사한다. 이러한 결과는 baicalein이 Nrf2의 활성제로서 PM에 의한 피부 세포의 손상을 차단할 수 있는 잠재력이 매우 높음을 시사한다.

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Fig. 4. Attenuation of the protective effect of baicalein against PM2.5-induced ROS generation and cytotoxicity following inhibition of HO-1 activity in HaCaT keratinocytes. Cells were pretreated with or without 100 μM baicalein or 10 μM ZnPP alone or together for 1 hr and then stimulated with H2O2 for 1 hr (A and B) or 48 hr (C). (A and B) Cells were stained with DCF-DA, and subjected to flow cytometry. Representative histograms (A) and quantitative change results (B) are presented. (C) Cell viability was assessed using the MTT assay. ***p<0.001 vs. control; ###p<0.001 vs. PM2.5-treated cells.

본 연구의 주요 결과는 HaCaT 각질형성세포에서 baicalein이 ROS의 생성 억제를 줄여 PM2.5에 의한 세포 독성을 감소시켰다는 것이며, 이는 Nrf2/HO-1 축의 활성을 통해 이루어졌다는 것이다. 그러나 본 연구에는 몇 가지 한계점이 있다. 첫째, 비록 baicalein이 PM2.5에 의한 ROS의 생성을 감소시켰으나, ROS 생성의 출처에 관한 연구가 미흡하다. 이는 미토콘드리아 손상과 연계되었을 것으로 추정되며, PM2.5에 의한 미토콘드리아 손상을 baicalein이 억제할 수 있다는 추가 연구가 요구된다. 둘째, 기전적인 측면에서 baicalein에 의한 Nrf2 조절 상위 세포 내 주요 신호계의 역할에 대한 규명이 요구된다. 특히, Nrf2의 인산화를 촉진하는 상위 신호계와 Nrf2에 대한 어댑터 단백질(adaptor protein) 역할을 하는 Keap1이 PM2.5에 의하여 조절되는 경로와 이에 미치는 baicalein의 영향도 해결해야 할 과제일 것이다. 셋째, 이 연구는 in vitro 수준에서 수행되었으므로 그 결과가 in vivo 조건에 완전히 적용되지 않을 수 있다. 제안된 baicalein의 항산화 잠재력을 확인하기 위한 동물 모델을 사용한 추가적인 생체 내 연구가 필요하다. 이러한 연구는 PM2.5에 의해 유발되는 피부 손상에 대한 baicalein의 치료적 잠재력과 안정성을 명확히 하는 데 도움이 될 것이다. 이러한 한계에도 불구하고 이 연구는 PM2.5 유도 산화 스트레스에 대한 baicalein의 항산화 기전에 대한 기초자료로서 가치가 높으며, 치료적 응용 분야에서 잠재력을 탐구하는 것을 목표로 하는 추가 연구 필요성의 근거가 될 것이다.

감사의 글

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(RS-2021-NR059329).

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.

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